鲶鱼骨酶解物抑菌性能研究

任小青，马俪珍，储炬

（1.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2.天津农学院 食品科学系，天津 300384；3.天津市农产品加工科技创新与成果转化基地，天津 300384）

鲶鱼（Catfish）属鲶形目，鲶科，是古老鱼类之一，具有适应性强、繁殖率高等特点，是极为重要的经济鱼类[1]。近年来，国内以鲶鱼为主的淡水渔业得到了飞速发展，由天津农学院和天津德仁水产养殖有限公司共同承担的“革胡子鲶设施化高效养殖技术研究项目”，通过高密度、集约化养殖，使革胡子鲶单位年产量提高了近40倍[2]。随着鲶鱼产量的增加，鲶鱼被加工成不同的产品，在加工过程中，大量的鱼头、鱼骨、鱼皮、内脏等废弃物产生，这些下脚料若不加以有效利用，不仅造成极大的浪费，而且还会对环境造成污染[3]。本实验室以鲶鱼加工下脚料鱼骨为原料，通过胃蛋白酶酶解得到了具有抑菌性能的酶解物[4]。在此基础上，本文进一步研究该酶解物的抑菌能力，为实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鲶鱼：天津市德仁水产养殖中心。胃蛋白酶（pH 3.0，活力1.25万U/g）：购自天津诺奥酶制剂公司。供试菌种大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和藤黄微球菌（M.luteus）为天津农学院食品科学系生物工程教研室保存。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。培养基配方：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，pH 7.2。

电子分析天平（FA1104A）、电子天平（JT3101N）：上海精密实验设备有限公司；电热恒温水浴锅（WHY-2）：天津市华北实验仪器有限公司；离心机（TDL-5）：上海安亭科学仪器厂；冰箱（BCD-241WE/Y）：海尔科技有限公司；灭菌锅（YX2808）：上海三申医疗器械有限公司；超净工作台：苏州净化设备有限公司；恒温培养箱：天津市天宇技术实业有限公司；722型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲶鱼骨酶解物的制备[4]

将新鲜鲶鱼的鱼头、鱼骨清洗干净，进行蒸煮、干燥和粉碎处理后以胃蛋白酶进行酶解。酶解的工艺条件为：底物浓度0.15 g/mL，加酶量1.97 g/100 g，酶解温度40℃，酶解时间4.0 h，pH 3.5。酶解后85℃灭酶10 min，离心20 min（4000 r/min）得上清液，上清液冷冻干燥制得具有抑菌性能的酶解物，-20℃储存备用。

1.2.2 菌种的活化培养

将-18℃甘油保藏菌种大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和藤黄微球菌（M.luteus）按1%接种量接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中或于固体牛肉膏蛋白胨培养基上划线培养，反复三次进行活化。

1.2.3 琼脂孔穴扩散法测定抑菌活性

在直径为9 cm的平皿内倾倒15 mL牛肉膏蛋白胨固体培养基以及调整好浓度的处于对数生长期的各株细菌，使培养基内的细菌终浓度为106CFU/mL，待其凝固后用无菌打孔器打直径为6 mm的孔，孔中加入35 μL骨酶解液，将平皿置于恒温培养箱中37℃培养18 h，测量其抑菌圈直径。

1.2.4 最低抑菌浓度的测定（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）

采用琼脂稀释法，用融化并保温在50℃的固体培养基将骨酶解物配成不同浓度，分别为10 mg/mL，8、6、4、2和0，倒平板，待其凝固，吸取0.1 mL培养到对数生长期浓度为106CFU/mL的菌液，用灭菌涂棒涂布均匀，置于37℃培养箱中培养24 h，观察并记录结果，以与培养基表面无菌落生长相对应的最小酶解物浓度为酶解物对各菌的最低抑菌浓度。以不加酶解物的各菌平板为对照。

1.2.5 最低杀菌浓度的测定（Minimal Bactericidal Concentration，MBC）

将1.2.4中大于及等于最低抑菌浓度的培养基表面用无菌水冲洗，将冲洗液接种到无酶解物的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，用灭菌涂棒涂布均匀，置于37℃培养箱中培养24 h，观察并记录实验结果，以与培养基表面无菌落生长相对应的最小酶解物浓度，即为酶解物对各菌的最低杀菌浓度。

1.2.6 比浊法测定细菌生长抑制曲线

称取一定量的骨酶解物，用牛肉膏蛋白胨培养基将其稀释成为各菌MIC，各菌种接种量均为5%，以不加酶解物的培养基接种作为空白对照，置于37℃下恒温振荡培养，定时取样测定其吸光度值，用吸光度值的变化反映浊度的变化，即细菌数量的变化。

1.2.7 加热时间对鲶鱼骨酶解物抑菌性能的影响

以大肠杆菌为供试菌，将其对应的最低抑菌浓度的酶解物在沸水浴中加热5、10、15、20、30、60 min，用1.2.3方法检测其抑菌活性变化，同时以未煮沸的最低抑菌浓度的酶解物作对照。

1.2.8 不同pH对鲶鱼骨酶解物抑菌性能的影响

以大肠杆菌为供试菌，配制缓冲液调节最低抑菌浓度的酶解物的pH至5、6、7、8、9，用1.2.3的方法检测其抑菌活性变化，同时以未调pH的最低抑菌浓度的酶解物作对照。

2 结果与分析

2.1 最低抑菌浓度MIC和最低杀菌浓度MBC的测定

将鲶鱼骨酶解物采用琼脂稀释法配成10 mg/mL，8，6，4，2和0不同浓度分别测定其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的MIC和MBC。测定结果见表1和表2。

表1 鲶鱼骨酶解物对各菌最低抑菌浓度（MIC）的测定Table 1 Minimal inhibitory concentration（MIC）of enzymatic hydrolysis of catfish bone

表2 鲶鱼骨酶解物对各菌最低杀菌浓度（MBC）的测定Table 2 Minimal bactericidal concentration（MBC）of enzymatic hydrolysis of catfish bone

从表1和表2可以看出，鲶鱼骨酶解物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌均具有很好的抑制作用，其中对藤黄微球菌抑制作用最强，其MIC和MBC分别是6 mg/mL和8 mg/mL。

2.2 比浊法测定细菌生长抑制曲线

以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌为对象菌，研究鲶鱼骨酶解物对其抑制效果，图1～图3分别为骨酶解物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的生长抑制曲线图。

由图1～图3可以看出，分别以正常培养的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌为阴性对照，当加入鲶鱼骨酶解物后，各菌的生长曲线均发生了明显的变化。这说明鲶鱼骨酶解物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌均有抑制作用而且抑制作用均发生在延迟期和对数生长前期。

图1 鲶鱼骨酶解物对大肠杆菌生长曲线的影响Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis of catfish bone on E.coli growth curve

图3 鲶鱼骨酶解物对藤黄微球菌生长曲线的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis of catfish bone on M.luteus growth curve

2.3 加热时间对鲶鱼骨酶解物抑菌性能的影响

将8 mg/mL的鲶鱼骨酶解物在沸水浴中加热5、10、15、20、30、60 min，检测其对大肠杆菌抑制活性变化，结果见图4。

图4 加热时间对鲶鱼骨酶解物抑菌性能的影响Fig.4 Effect of heating time on the antibacterial activity of enzymatic hydrolysis of catfish bone

由图4可以看出，最低抑菌浓度的酶解物在沸水浴中加热不同时间后，随处理温度的升高，对大肠杆菌的抑菌活性略有下降，但是整个曲线的变化过程较为平缓，抑菌圈直径与对照相差不大。这说明高温长时间处理对鲶鱼骨酶解物的抑菌活性影响较小，提取物具有较好的热稳定性。

2.4 不同pH对鲶鱼骨酶解物抑菌性能的影响

配制缓冲液调节8 mg/mL的鲶鱼骨酶解物pH至5、6、7、8、9，检测其抑菌活性变化，结果见图5。

图5 pH对鲶鱼骨酶解物抑菌性能的影响Fig.5 Effect of pH on the antibacterial activity of enzymatic hydrolysis of catfish bone

由图5可以看出，8 mg/mL的鲶鱼骨酶解物的抑菌性能受pH影响较大，随着pH的增大，抑菌性能迅速降低，这可能是由于碱性环境破坏了鲶鱼骨酶解物中抑菌活性物质的结构。

3 结论

本实验结果表明，鲶鱼骨酶解物均能很好的抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的生长，其中对藤黄微球菌抑制作用最强，其MIC和MBC分别是6 mg/mL和8 mg/mL。而且鲶鱼骨酶解物的抑菌活性具有较好的热稳定性但随着pH的增大，抑菌性能迅速降低。

[1]何顺昌.革胡子鲶池塘精养高产技术[J].中国水产，2009(2):34-35

[2]周润健.新技术使鲶鱼产量提高近40倍 [N].中国食品质量报，2006-5-23(4)

[3]Yang H,Wang Y,Jiang M,et al.2-step optimization of the extraction and subsequent physical properties of channel catfish（Ictalurus punctatus）skin gelatin[J].Journal of Food Science，2007，72(4):188-195

[4]Ren X,Ma L,Chu J,et al.&An,H.Optimization of enzymatic hydrolysis of channel catfish bones for preparing antibacterial agents[J].Journal of Aquatic Food Product Technology,accepted,in press