薄层色谱法测定蜂蜜中高果糖淀粉糖浆

2011-12-01张颖璐刘明刚李琳

食品研究与开发 2011年12期

张颖璐，刘明刚，李琳

（天津市质量监督检验站第六十九站，天津 301609）

如今蜂蜜市场中出现了许多掺假现象，这些人利用高果糖淀粉糖浆具有颜色和味道与蜂蜜极为相似，但价值比蜂蜜便宜很多的特点，向蜂蜜中掺入高果糖淀粉糖浆，为此，鉴别真假蜂蜜的技术也应运而生，主要有同位素质谱法、薄层色谱法等，由于同位素质谱法所采用的仪器设备较为昂贵，所以薄层色谱法被广泛使用[1]。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

无水乙醇（分析纯）；正丁醇（分析纯）；冰乙酸（分析纯）；丙酮（分析纯）；磷酸（优级纯）；85%磷酸；活性炭：DarcoG-60或相当者，100目；硅藻土：Celite545助滤剂或相当者；二苯胺盐酸盐（C.A.S.：537－67－7）；苯胺:重蒸馏。

乙醇溶液（7＋93）：移取35 mL无水乙醇至500 mL试剂瓶中，加人465 mL水混匀。

乙醇溶液（1＋3）：移取125 mL无水乙醇至500 mL试剂瓶中，加人375 mL水混匀。

乙醇溶液（1＋1）：移取250 mL无水乙醇至500 mL试剂瓶中，加人250 mL水混匀。

薄层展开剂：正丁醇＋冰乙酸＋水（2＋1＋1）。

显色剂：称取1.0 g二苯胺盐酸盐（3.9）至盛有50.0 mL丙酮（4.4）的烧杯中，再加入1 mL苯胺（3.10），混合搅拌，同时加人5 mL 85%的磷酸（3.6），此时会有白色絮状出现，完全溶解后可使用。此显色剂要临用时现配，各种试剂要按以上顺序添加。

薄层层析板:硅胶G板200 mm×200 mm或100 mm×200 mm（根据实际做样品数选择合适规格的硅胶G板），膜厚0.25 mm，使用前应画板，画板方法为下端留2 cm，左边和右边各留2 cm，从下端2 cm处向上量3.5 cm位置画线，此线为Rf值，从下端2cm处向上量10cm位置画线，此线为爬板终点线，爬过此线视为爬板结束，画好板后要在110℃恒温干燥箱中活化1 h后，置于干燥器中放冷至室温，备用。

水：本实验中所用水均为经滤膜抽滤过的蒸馏水。

1.2 仪器和设备

HW.B-2恒温干燥箱：天津东方实验厂；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；玻璃喷雾器:薄层色谱用；SHZ－D（Ⅲ）真空抽气泵（可调真空度0～100 kPa）：北京莱伯泰科仪器有限公司；薄层色谱展开槽；微量注射器（10 μL）；AEG220G分析天平（感量:0.0001 g）：日本岛津公司；电吹风机；层析柱：带旋塞的玻璃管，内径20 mm～22 mm，长300 mm～400mm。

1.3 方法

试样中的高分子糖，经活性炭—硅藻土柱的富集、浓缩，再用薄层色谱法分离、检测，经与掺有一定含量的高果糖淀粉糖浆的纯蜂蜜比较，来判定蜂蜜中高果糖淀粉糖浆的存在。

1.3.1 活性炭柱-硅藻土柱的装填与保存

用玻璃棉将脱脂棉包成小包塞在柱子底部，关掉活栓后加水到玻璃管的中部，放水除去玻璃棉中的气泡至水量约10 mL时关掉活栓。在小烧杯中称取2.0 g的硅藻土（1.1.8），加入少量的水搅拌注入管中，自然沉降后在玻璃棉的上方堆积成约1 cm厚的硅藻土层。称取活性炭（1.1.7）和硅藻土混合物（1＋1）12 g，加入50 mL的水搅拌均匀注人管中（由于硅藻土和活性炭比重不同，必须搅拌均匀后方可注入管中，否则会影响柱效）。打开活栓，在真空抽气泵的吸引下使混合物沉降堆积，用水将粘在管壁的混合物冲洗干净，整个过程需要用150 mL水来过柱，水面到达柱面1 cm时关掉活栓。再次注入用水混合后的2.0 g硅藻土，让其自然沉降后，在真空抽气泵吸引下，用500 mL水预洗活性炭柱，通过调节真空抽气泵的真空度控制流速在8.5 mL/min左右。液面到达柱上1 cm时关掉活栓，备用。注意：以上操作过程中均不能将柱子抽干。

应在使用前填装，如暂时不用，可用乙醇溶液（1＋1）150 mL浸泡，用保鲜膜和生料带封口，此法可保存3个月，用前再用500 mL水预洗。若用水封，则可保存1个月。

1.3.2 试样制备与保存

对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。分出0.5 kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并标明标记。将试样于常温下保存。

1.3.3 分析步骤

1.3.3.1 样品前处理

1）过柱

在50 mL烧杯中称取1 g（精确到1 mg，且小数点后第4位应小于5）试样。溶于10 mL水后，缓慢加到活性炭－硅藻土柱上，打开活栓，在真空抽气泵吸引下，使试料溶液通过柱子。分2次各用5mL水冲洗烧杯后，冲洗液也加人柱中，液面下降到柱面上端时应关闭活栓，停止吸引，不要抽干液体。量取乙醇溶液（7＋93）300 mL（每次100 mL，分3次）加到活性炭柱中，真空抽吸控制流速在8 mL/min左右，弃掉流出液。然后再加人乙醇溶液（1+3）100 mL，在同样条件下洗脱，洗脱液全部弃掉，并将液体抽干，观察活栓下不再有液体滴下，视为已抽干。然后将接收瓶换成在干燥器中干燥过的具塞锥形瓶，再加入乙醇溶液（1+1）100 mL，在同样条件下洗脱，将洗脱液全部收集，并要收集完全，观察不再有液体滴入锥形瓶为止。

2）旋转蒸发

用旋转蒸发器在80℃水浴中蒸干，开始温度不要过高，设置在65℃左右为佳，温度慢慢升高，这个过程要注意不要使锥形瓶中的液体沸腾而丢失，否则会造成样品丢失。将锥形瓶中的液体蒸干后，向瓶中加入1 mL水，用玻璃棒把粘在瓶底及瓶身的混合物洗下来，然后过水系滤头，转移至2 mL小管中，作为薄层层析用点样液。

1.3.3.2 对照样品的制备与保存

分别称取1 g蜂蜜，1 g蜂蜜并加入0.0650 g糖浆、1 g蜂蜜并加入0.1300 g糖浆（注：1 g蜂蜜精确到1 mg，且小数点后第4位应小于5）。后按1.3.3.1操作，制备对照样品纯蜂蜜，含有5%、10%糖浆蜂蜜。标准液可以一次制备冷冻保存，长期使用。

1.3.3.3 薄层层析

1）点板

用10 μL微量注射器在距离薄层板下端2 cm的位置，点上6.0 μL的样液，同时水平间隔2 cm，点上同样量经过同样处理的纯蜂蜜和含有5%、10%糖浆的蜂蜜的标准液作为对照。点样时点越小，越集中爬板效果就越好，点一下就要迅速用吹风机吹干。

2）爬板

点样结束后把薄层板放入展开槽中（薄层展开前，展开槽用展开剂蒸气预饱和过夜，用一张滤纸将展开槽四壁围好，并将展开槽密封），按倾斜上行法展开，为加快爬板速度可将展开槽放在温度较高的室内，以加快分子反应速度。当展开剂前沿爬过薄层板终点线时即可。

3）显色

从展开槽中取出薄层板，用吹风机把展开剂完全吹散后，把显色剂（1.1.15）均匀喷雾在薄层板上，等显色剂完全蒸发后，放入110℃的恒温干燥箱中烘7 min～10 min使之显色。

1.3.3.4 结果判定

从恒温干燥箱中取出薄层板，观察显色情况，纯蜂蜜只在Rf值0.35以上的区域有2个～3个蓝色中带灰色或咖啡色的斑点，相比较糖浆或混有糖浆的蜂蜜却是从原点开始呈现蓝色带状样的斑点群。混有糖浆5%的蜂蜜，如果点样6 μL，可出现混有糖浆蜂蜜一样的特点。因此，假如从原点开始到Rf值0.35附近有蓝色带状斑点群出现，应考虑混有由淀粉转化来的高果糖淀粉糖浆，此时判定阳性。检出限为5%。