金针菇子实体多糖的抗氧化活性的研究

傅明辉，洪梅达

（广东工业大学 食品与生物工程系，广东 广州 510006）

食用菌多糖具有免疫调节，抗肿瘤作用，调节血糖、降血脂作用，抗氧化，抗衰老作用以及抗辐射和抗突变作用，广泛应用于临床治疗以及保健功能上。如香菇多糖具有广谱的抗病毒、抗肿瘤及刺激巨噬细胞活性和对胆固醇的溶解作用，并能作为调节机体免疫反应的T细胞促进剂，通过刺激抗体的产生提高机体的免疫功能[1-5]；灵芝子实体多糖能增强巨噬细胞的吞噬活力，促进蛋白质合成，改善造血功能，增强机体的防御功能[5-6]，同时具有降血糖、降血脂的作用[7-8]。茶树菇子实体多糖具有抗氧化的活性[9]。

金针菇（Flammulina velutipes）又名朴菇、冬菇，是一种常见食用菌，具有丰富的营养价值。据分析，金针菇（干制品）含有丰富的蛋白质（31.2%）、碳水化合物（60.2%）和粗脂肪（5.8%），还含有VB1、VB2、VC等多种维生素，其含量丰富的精氨酸和赖氨酸对促进少年儿童智力发育具有良好作用，日本人把它誉为“增智菇”[10]。金针菇不但食用价值高，还具有一定的药用价值。据报道，其子实体提取物具有保肝及抗肿瘤作用[11-12]，其多糖是一个以葡聚糖为主、由数个多糖组分构成的混合多糖[13]，能够增强机体免疫力[14]，具有抗凝血[15]等生理功能，但有关金针菇多糖的抗氧化作用的研究还鲜有报道。本文对金针菇多糖进行分离、纯化并对其抗氧化活性进行研究，研究结果为金针菇多糖的进一步开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金针菇：购自广州长湴市场。昆明种小白鼠：购自广州中医药大学实验动物中心。DEAE52、Sephadex S-200：Sigma公司；其余化学试剂均为国产。

1.2 仪器与设备

高速组织捣碎机（DS-1型）：上海标本模型厂制造；旋转蒸发器（RE-52A型）：上海亚荣生化仪器厂；低速离心机（KDC-40型）：大创新股份有限公司中佳分公司；可见分光光度计（1201型）：北京瑞利分析仪器公司；自动部分收集器（BSZ-100）：上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取

称取100 g新鲜金针菇子实体，加适量蒸馏水，匀浆。保持料液比为1∶40（g∶mL），在100 ℃水浴中加热搅拌3 h，过滤，如此反复3次，合并收集滤液，离心30 min（4000 r/min），取上清液浓缩至小体积。加入3倍体积的无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀。将沉淀溶解于水中，在透析袋中，对自来水透析24 h，再对蒸馏水透析48 h。Sevage法脱蛋白，重复脱蛋白5次。加入3倍体积无水乙醇沉淀，在4℃冰箱中静置过夜。离心，收集沉淀，以无水乙醇洗涤。离心15 min（4000 r/min），除去乙醇，干燥，得粗多糖。样品中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。

1.3.2 多糖的DEAE离子交换柱层析

DEAE52-纤维素离子交换柱层析（10 mm×200 mm），用0.05mol/L NaCl溶液洗脱，流速0.75mL/min，收集4 mL/管，苯酚-硫酸显色法测定多糖含量。65℃～70℃减压旋转蒸发样液，浓缩至1 mL后，真空干燥获得纯多糖A1和A2。

1.3.3 多糖的凝胶柱层析

取经DEAE柱纯化得到的多糖A2样品，用少量0.05 mol/L NaCl溶液溶解，65℃～70℃减压旋转蒸发浓缩至1 mL～2 mL。样品加入Sephadex S-200凝胶柱中（16 mm×500 mm），用浓度为0.05 mol/L NaCl溶液洗脱，流速0.2 mL/min，收集2 mL/管，苯酚-硫酸显色法测定多糖。

1.3.4 多糖抗氧化活性的检测[16]

选取体重20 g左右的健康小鼠，脱颈椎处死，取肝脏以0.9%生理盐水研磨成2%的匀浆液。取1.5 mL匀浆液，加入0.5 mL纯化后的A2组分（或生理盐水作对照），混匀，静置10min，然后放入37℃恒温箱中振荡1.5h，取出加入1.5 mL 20%三氯乙酸，混匀以终止氧化反应，10 min后1000 r/min离心10 min。取上清液1.5 mL加入0.5 mL 0.67%硫代巴比妥酸，沸水浴10 min，冷却后用分光光度计测光密度（波长=540 nm）。另取1.5 mL匀浆液，加入1.5 mL 20%三氯乙酸先终止反应，然后再加入0.5 mL纯化后的A2组分（或生理盐水），余下步骤同上，用作空白调零，取3个不同浓度的样品，每个浓度分别取3支平行管，记录结果。

2 结果与分析

2.1 多糖的分离与纯化

100g新鲜金针菇经热水浸提后制备粗多糖1.092g，提取率1.092%。

粗多糖经DEAE52-离子交换柱后的结果见图1，图中可见2个明显的峰，说明粗多糖中包含2种组分A1和A2（A1和A2不一定是纯品）。多糖A2再经过SephadexS-200凝胶柱层析后，结果见图2，得到一个基本对称单峰，说明A2组分是纯的多糖。

图1 DEAE52柱层析洗脱图谱Fig.1 The elution curve of DEAE52 column chromatography

2.2 多糖抗氧化活性的测定

金针菇多糖样品抗氧化活性检测数据如表1所示。

图2 Sephadex S-200柱层析洗脱曲线Fig.2 The elution curve of Sephadex S-200 column chromatography

表1 金针菇多糖的抗氧化作用Table 1 The anti-oxidant activity of polysaccharide from Flammulina velutipes

本实验的结果显示，生理盐水为对照，金针菇多糖的3个浓度均有抗氧化作用。在样品浓度较低，为0.007 mg/mL时，OD值下降了36.5%，随着样品浓度升高到0.014 mg/mL和0.028 mg/mL时，OD值下降百分率分别达到40.0%及48.5%，其光密度降低都具有比较明显的差异，量效关系显著，即随着浓度的升高，抗氧化作用明显上升。

3 结论

我国是食用菌生产大国，食用菌的开发和利用具有重要的意义。食用菌多糖是食用菌中一种重要的活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒及提高机体免疫功能等生物学活性，这在香菇、灵芝、虫草、姬松茸等常见食用菌中以得到证实[1-9，17-19]，金针菇多糖也具有抗肿瘤、提高机体免疫的活性，但有关金针菇多糖的抗氧化研究鲜有报道。本研究采用热水浸提的方法分离金针菇多糖，结合DEAE52-纤维素离子交换柱层析和Sephadex S-200凝胶柱层析纯化多糖，得到单一多糖组分A2，并对其抗氧化活性进行了研究，研究结果表明金针菇具有明显的抗氧化活性，且抗氧化活性呈现剂量效应，随浓度升高而升高，该研究结果为金针菇的进一步开发和利用提供一定的参考。

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