亚硒酸钠对结直肠癌HCT 116和SW480细胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表达的影响

罗 慧，杨 洋，许彩民

中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

·论著·

亚硒酸钠对结直肠癌HCT116和SW480细胞中β-catenin及下游靶基因cyclinD1表达的影响

罗 慧，杨 洋，许彩民

中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

目的研究亚硒酸钠对结直肠癌HCT 116和SW480细胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表达的影响。方法采用10μmol/L亚硒酸钠处理HCT 116和SW480细胞， Western blot及RT-PCR检测亚硒酸钠处理后不同时间HCT 116和SW480细胞中β-catenin和cyclin D1的表达情况，并观察蛋白酶体抑制剂MG132预处理后对HCT 116和SW480细胞中β-catenin和cyclin D1表达的影响。采用免疫共沉淀方法检测亚硒酸钠对HCT 116和SW480细胞中β-catenin与T细胞因子4(TCF4)相互作用的影响。结果亚硒酸钠可降低HCT 116和SW480细胞中β-catenin和cyclin D1的表达水平，用蛋白酶体抑制剂MG132预处理可增加亚硒酸钠处理后HCT 116和SW480细胞中β-catenin和cyclin D1的表达水平。免疫共沉淀实验结果显示，亚硒酸钠能破坏β-catenin与TCF4间的相互作用。结论亚硒酸钠可降低结直肠癌HCT 116和SW480细胞中β-catenin及cyclin D1的表达水平，蛋白酶体介导的降解途径可能在这一过程中发挥了重要作用。亚硒酸钠引起的β-catenin与TCF4相互作用减少可能对β-catenin靶基因的转录也起到了一定的调控作用。

亚硒酸钠；结直肠癌；β-catenin; cyclin D1

结直肠癌是世界范围内发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一，开发新的治疗结直肠癌化疗药物的研究具有重要意义，能够与已有的手术切除、放射治疗等方法结合起来提高结肠癌的治愈率[1-2]。近来研究表明，硒化合物具有化疗和化学预防的作用，大量流行病学和部分临床资料也支持这一结论[3]。但是硒化合物的抗癌机制，尤其是特异性杀伤肿瘤细胞的分子机制目前尚不清楚。本课题组前期工作发现，超营养剂量的硒能诱导结直肠癌细胞发生凋亡，体内实验也表明，亚硒酸钠能够抑制结肠癌移植瘤的生长，诱导发生明显的细胞凋亡[4]。β-catenin在大部分结直癌细胞中都是异常激活的，过度激活的β-catenin能够促进其靶基因的表达，主要涉及一些促进细胞周期进行和抗凋亡基因，如：cyclin D1、survivin等，这些效应导致细胞过度增殖和降低细胞凋亡发生的敏感性，最后为细胞发生恶性转化和肿瘤发生进行提供必要的条件[5-6]。而这些蛋白很多都可以成为治疗多种恶性肿瘤的分子靶标。本研究观察了亚硒酸钠对结直肠癌HCT 116和SW480细胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表达的影响。

材料和方法

材料人来源的结直肠癌细胞系HCT 116和SW480细胞购自中国医学科学院基础医学研究所，亚硒酸钠(纯度98%)购自美国Sigma-Aldrich公司，鼠抗人β-catenin抗体、兔抗人T细胞因子4(T cell factor 4，TCF4)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，MG132购自美国Calbiochem公司。

细胞培养将HCT 116、SW480细胞培养于含10%胎牛血清(天津灏洋生物公司)、0.2%碳酸氢钠、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)中，孵箱温度37℃, CO2含量5%。

Westernblot检测收集1×107个细胞，用预冷PBS洗两次，RIPA裂解液[20 mmol/L Tris(pH7.5)+150 mmol/L氯化钠+1 mmol/L EDTA+1 mmol/L EGTA+1% Triton X-100+2.5 mmol/L焦磷酸钠+1 mmol/L 甘油磷酸+1 mmol/L原钒酸钠+1 μg/ml亮肽素+1 mmol/L PMSF]裂解细胞，超声5 s，每个样品10次，离心收集上清液即为总蛋白溶液。用Bradford法测量蛋白含量，取等量蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，以含5%脱脂牛奶的TBST溶液室温封闭1 h，兔抗人TCF4抗体(1∶1000)、鼠抗人β-catenin抗体(1∶2000)孵育4℃过夜。TBST洗膜，用相应的辣根过氧化物酶标记的二抗常温孵育1 h，TBST洗膜后ECL显色发光检测相应条带。β-actin作为内参照。所有实验至少重复3次。

RT-PCR采用Trizol Reagents (美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA。取2 μg RNA用M-MLV、Oligo dT (美国Promega公司)反转录为cDNA，然后进行PCR。反应体系包括β-catenin、cyclin D1、GAPDH的正向引物和反向引物各2 μl，反应缓冲液7.8 μl。反应条件：94℃ 10 min，94℃ 30 s，54℃ 20 s，72℃ 40 s，30个循环。所有PCR引物由上海生工公司合成，序列为:(1)β-catenin: 5’-ATTTGATGGAGTTGGACATGGC-3’(正向)，5’-CCAGCTACTTGTTCTTGA- GTGAAGG-3’(反向)；(2)cyclin D1: 5’-TCTAAGATGAAGGAGACCATC-3’，5’-GCGGTAGTAGGACAGGAAGTTGTT-3’(反向)；(3) GAPDH：5’-CAACA- GCCTCAAGATCATCAGC-3’(正向)，5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3’(反向)。用1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。所有实验至少重复3次。

免疫共沉淀约6×105个细胞经过PBS溶液或硒处理24 h后，收集细胞，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min(r=8.5 cm)离心收集蛋白上清；Bradford法对蛋白定量后，调蛋白浓度成一致；用相应一抗免疫沉淀目的蛋白，4℃，旋转过夜；然后用25 μl琼脂糖珠子捕获免疫沉淀复合物，4℃反应3 h；RIPA洗涤沉淀复合物3遍，3×SDS loading buffer重悬沉淀，煮沸后使蛋白变性；离心收集样品上清，-80℃保存或进一步用Western blot检测。

结 果

亚硒酸钠对HCT116和SW480细胞中β-catenin表达的影响采用10 μmol/L亚硒酸钠处理HCT 116和SW480细胞，分别在处理后0、6、12、24 h提取细胞RNA或总蛋白，RT-PCR检测结果显示，随着处理时间延长，HCT 116细胞中的β-catenin mRNA表达水平下降，而SW480细胞中没有明显变化；Western blot检测结果显示，随着处理时间延长，HCT 116和SW480细胞中的β-catenin蛋白表达水平均下降(图1)。

亚硒酸钠对HCT116和SW480细胞中cyclinD1表达的影响RT-PCR和Western blot检测结果显示，随着处理时间延长，HCT 116和SW480细胞中cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平均下降(图2)。

蛋白酶体抑制剂MG132对亚硒酸钠处理后HCT116和SW480细胞中β-catenin和cyclinD1表达的影响将HCT 116和SW480细胞用MG132预处理1.5 h后，再用亚硒酸钠处理24 h，提取总蛋白，Western blot检测结果显示，MG132与亚硒酸钠联合处理组HCT 116和SW480细胞中β-catenin和cyclin D1蛋白表达水平高于亚硒酸钠单独处理组 (图3)。

亚硒酸钠对HCT116和SW480细胞中β-catenin与TCF4相互作用的影响用亚硒酸钠处理HCT 116和SW480细胞24 h后，用RIPA裂解提取总蛋白，定量后分别用β-catenin抗体和TCF4抗体免疫共沉淀细胞总蛋白，Western blot检测结果显示，亚硒酸钠处理的HCT 116和SW480细胞中，β-catenin与TCF-4蛋白的结合明显减少(图4)。

讨 论

β-catenin除了存在于细胞膜内侧通过钙黏蛋白和肌动蛋白在细胞连接中发挥作用外，也是Wingless/Integrated(Wnt)信号通路中的重要成员，在没有Wnt信号激活的情况下，胞质游离的β-catenin可被由糖原合成激酶3β(glycogen Synthase 3β，GSK3β)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)等蛋白组成的蛋白破坏复合体降解，而当Wnt脂多糖配体与Frizzled受体及低密度脂蛋白的受体相关蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)辅助受体结合后，可以募集接头蛋白至细胞膜上，磷酸化的LRP5/6也可以募集CKI蛋白，从而使结肠腺瘤样息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)/GSK3β不能有效启动β-catenin的泛素化降解。积累的胞质β-catenin能够通过APC等蛋白的作用转入核内，与核内转录因子TCF4/淋巴增强子结合因子1(lymphoid enhancer-binding factor，LEF-1)相互结合，继而结合到靶基因的启动子位点促进转录，从而达到维持肿瘤细胞生存的目的[7-8]，同时β-catenin受到包括蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)、c-jun氨基端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)等众多激酶所组成的信号网络所调控[9-11]。本课题组前期工作发现，超营养剂量的亚硒酸钠能够诱导结直肠癌细胞HCT 116和SW480发生细胞凋亡，本研究则观察了亚硒酸钠对结直肠癌细胞HCT 116和SW480中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表达的影响。

A．RT-PCR检测结果；B.Western blot检测结果A．results of RT-PCR；B. results of Western blot analysis

A．RT-PCR检测结果；B.Western blot检测结果A．results of RT-PCR；B. results of Western blot analysis

图3 MG132对亚硒酸钠(10 μmol/L)处理后HCT 116和SW480细胞中β-catenin和cyclin D1蛋白表达的影响Fig3 Effect of MG132 on β-catenin and cyclin D1 in selenite-treated colorectal cancer cells HCT 116 and SW480 (10 μmol/L)

A.β-catenin免疫共沉淀的Western blot结果；B. TCF4免疫共沉淀的Western blot结果A. results of Western blot analysis after β-catenin co-immunoprecipitation；B. results of Western blot analysis after TCF4 co-immunoprecipitation.

本研究首先检测了用亚硒酸钠处理HCT 116和SW480细胞不同时间后β-catenin和cyclin D1的表达情况，结果发现亚硒酸钠能够抑制HCT 116和SW480细胞中β-catenin和cyclin D1的表达，但在转录水平，HCT 116和SW480细胞则表现出对亚硒酸钠不同的敏感性，亚硒酸钠能够抑制HCT 116细胞中β-catenin的转录，但对SW480细胞则无影响，推测这可能是由细胞本身的基因型决定的。SW480细胞中β-catenin编码基因完整性决定了其能够被硒诱导的降解途径所调控，所以转录水平表现出不敏感性；HCT 116细胞中的β-catenin基因是在编码ser45的序列时突变的，造成其不能被APC/GSK3β破坏复合体所降解[12]。

用蛋白酶体抑制剂MG132预处理的结果显示，其可增加亚硒酸钠处理后HCT 116和SW480细胞中β-catenin和cyclin D1的表达水平，提示蛋白酶体抑制剂MG132可在一定程度上逆转亚硒酸钠所引起的β-catenin及其下游靶基因cyclin D1表达的抑制，说明可能存在除经典的破坏复合体之外的分子介导β-catenin发生泛素化降解[13]。

此外本研究还发现，亚硒酸钠能够明显破坏β-catenin与核内辅助因子TCF4间的相互作用，提示可能还存在其他相互作用蛋白与β-catenin竞争性结合。有研究显示，Forkhead box(FOXO)家族蛋白可能竞争性与β-catenin结合，阻止β-catenin与TCF4结合，从而抑制其靶基因cyclin D1和survivin等的转录[14-15]。FOXO家族蛋白也可通过促进Bcl-2家族的促细胞凋亡蛋白，如Bim和Puma的表达来促进细胞凋亡的发生[16]。

综上，本研究结果显示，亚硒酸钠可降低结直肠癌细胞HCT 116和SW480中β-catenin及cyclin D1的表达水平，蛋白酶体介导的降解途径可能在这一过程中发挥了重要作用。亚硒酸钠引起的β-catenin与TCF4相互作用减少可能对β-catenin靶基因的转录也起到了一定的调控作用，这一系列的级联反应可能介导了亚硒酸钠引起结直肠细胞凋亡的发生。

[1] Hollande F, Pannequin J, Joubert D. The long road to colorectal cancer therapy: Searching for the right signals [J]. Drug Resist Updat, 2010, 13(1-2):44-56.

[2] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2009 [J]. CA Cancer J Clin, 2009, 59(4):225-249.

[3] Brozmanová J. Selenium and cancer: from prevention to treatment[J]. Klin Onkol, 2011, 24(3):171-179.

[4] Huang F, Nie C, Yang Y, et al. Selenite induces redox-dependent Bax activation and apoptosis in colorectal cancer cells [J]. Free Radic Biol Med, 2009, 46(8):1186-1196.

[5] Miyaki M, Iijima T, Kimura J, et al. Frequent mutation of beta-catenin and APC genes in primary colorectal tumors from patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer [J]. Cancer Res, 1999, 59(18):4506-4509.

[6] Liu X, Wang L, Zhao S, et al. β- Catenin overexpression in malignant glioma and its role in proliferation and apoptosis in glioblastma cells [J]. Med Oncol, 2011, 28(2):608-614.

[7] MacDonald BT, Tamai K, He X. Wnt/β-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases [J]. Dev Cell, 2009, 17(1):9-26.

[8] Lucero OM, Dawson DW, Moon RT, et al. A re-evaluation of the “oncogenic” nature of Wnt/β-catenin signaling in melanoma and other cancers [J]. Curr Oncol Rep, 2010, 12(5):314-318.

[9] Ponce DP, Maturana JL, Cabello P, et al. Phosphorylation of AKT/PKB by CK2 is necessary for the AKT-dependent up-regulation of beta-catenin transcriptional activity [J]. J Cell Physiol, 2011, 226(7):1953-1959.

[10] Fang D, Hawke D, Zheng Y, et al. Phosphorylation of beta-catenin by AKT promotes beta-catenin transcriptional activity [J]. J Biol Chem, 2007, 282(15):11221-11229.

[11] Fang W, Han A, Bi X, et al. Tumor inhibition by sodium selenite is associated with activation of c-Jun NH2-terminal kinase 1 and suppression of beta-catenin signaling [J]. Int J Cancer, 2010, 127(1):32-42.

[12] Dihlmann S, Klein S, Doeberitz Mv MK. Reduction of beta-catenin/T-cell transcription factor signaling by aspirin and indomethacin is caused by an increased stabilization of phosphorylated beta-catenin [J]. Mol Cancer Ther, 2003, 2(6):509-516.

[13] Xiao JH, Ghosn C, Hinchman C, et al. Adenomatous polyposis coli (APC)-independent regulation of beta-catenin degradation via a retinoid X receptor-mediated pathway [J]. J Biol Chem, 2003, 278(32):29954-29962.

[14] Hoogeboom D, Essers MAG, Polderman PE, et al. Interaction of FOXO with β-catenin inhibitsβ-catenin/T cell factor activity [J]. J Biol Chem, 2008, 283(14):9224-9230.

[15] Essers MA, de Vries-Smits LM, Barker N, et al. Functional interaction between beta- catenin and FOXO in oxidative stress signaling [J]. Science, 2005, 308(5725):1181-1184.

[16] Fu Z, Tindall DJ. FOXOs, cancer and regulation of apoptosis [J]. Oncogene, 2008, 27(16):2312-2319.

EffectsofSodiumSeleniteontheExpressionsofβ-cateninandItsTargetcyclinD1inColorectalCancerCellsHCT116andSW480

LUO Hui, YANG Yang, XU Cai-min

National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005, China

XU Cai-min Tel: 010-65296445, E-mail: caiminxu@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the effects of sodium selenite on the expressions of β-catenin and cyclin D1 in colorectal cancer cells HCT 116 and SW480.MethodsHCT 116 and SW480 cells were treated by 10μmol/L sodium selenite at different time points. The expressions and transcription of β-catenin and cyclin D1 were detected by Western blot analysis and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively. Meanwhile, the impact of MG132 (a proteasome inhibitor) pretreatment on the expressions of β-catenin and cyclin D1 was observed through Western blot analysis. The interaction between β-catenin and T cell factor 4 (TCF4) after selenite treatment was evaluated using co-immunoprecipitation assay.ResultsSodium selenite inhibited the expression of β-catenin and transcription of its target such as cylcin D1. MG132 pretreatment prevented the inhibition of β-catenin signaling triggered by selenite in HCT 116 and SW480 cells. Furthermore, selenite treatment disrupted the interaction between β-catenin and TCF4 in HCT 116 and SW480 cells.ConclusionsSodium selenite can lower the expression levels of β-catenin and its target cyclin D1, during which the proteasome-mediated degradative pathway may be involved. The decreased interaction between β-catenin and TCF4 due to sodium selenite may be also involved in the regulation of β-catenin signaling.

sodium selenite; colorectal cancer; β-catenin; cyclin D1

ActaAcadMedSin，2011，33(6)：654-658

许彩民 电话：010-65296445，电子邮件：caiminxu@yahoo.com.cn

Q735

A

1000-503X(2011)06-0654-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.014

国家自然科学基金(31170788、30970655)、国家青年科学基金(31101018)、北京市自然科学基金(5082015)和国家重点实验室专项经费(2060204)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (31170788, 30970655), the National Natural Science Foundation for young scholars of China (31101018), the Natural Science Foundation of Beijing (5082015), and the National Laboratory of Molecular Biology Special Fund (2060204)

2011-10-25)