小鼠大脑皮层层次特异表达基因天然反义转录物的筛选与鉴定

李 萍，张 靖，李爱花，王 珊，谈小超，阴 彬，彭小忠

中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

·论著·

小鼠大脑皮层层次特异表达基因天然反义转录物的筛选与鉴定

李 萍，张 靖，李爱花，王 珊，谈小超，阴 彬，彭小忠

中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

目的筛选并鉴定小鼠大脑皮层发育过程中皮层层次特异表达的基因是否存在天然反义转录物(NAT)。方法对63个小鼠大脑皮层层次特异表达的基因进行生物信息学预测，筛选出31个可能存在NAT的基因，从小鼠脑组织及神经系统来源的细胞系提取总RNA，采用RT-PCR方法对筛选阳性基因进行鉴定并克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果31个经生物信息学预测的基因中，8个为NAT阳性。结论小鼠大脑皮层发育过程中皮层层次特异表达的基因存在NAT，NAT可能通过调控编码基因影响小鼠皮层发育。

天然反义转录物；小鼠大脑皮层；筛选；鉴定

NAT由蛋白编码基因的反义链转录产生，属于一类新的长非编码RNA，其中少数可以编码蛋白，根据其编码方式可分为两种：(1)顺式NAT(cis-NAT)：与其对应编码基因来源于相同的基因组位点，由编码有义转录物的相对链所编码，与靶基因的序列完全互补；(2)反式NAT(trans-NAT)：与编码基因来源于不同的基因组位点，与有义转录物只是部分互补[1]。NAT与对应的正义RNA(sense RNA)通过碱基互补配对，形成正义-反义转录物(sense- antisense transcript，SAT)，影响靶mRNA的稳定性或翻译[2]。1976年，Barrell 等[3]在病毒中首次发现NAT的存在，此后越来越多有功能的NAT被发现在转录及转录后水平对其对应的sense RNA 发挥调控作用。Emx2为中枢神经系统表达的转录因子，可对大脑皮层发育中神经细胞的分化、迁移和神经前体细胞增殖等发挥重要的调控作用。Spigoni等[4]通过RT-PCR和原位杂交等技术发现，神经元前体细胞中Emx2OS-ncRNA对Emx2进行转录后下调，而敲除Emx2基因后Emx2OS-ncRNA转录水平降低，说明Emx2及其NAT之间存在相互调控，并可能间接影响神经系统发育。本研究以小鼠大脑皮层特异表达基因为研究对象，筛选并鉴定了其NAT。

材料和方法

材料pGEM-T 载体、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，反转录试剂盒购自日本Takara公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，T4 DNA连接酶，RQ1 RNase-Free DNase购自美国Promega公司。E12.5的胎鼠及成年小鼠品系均为ICR，所用细胞系为小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)和NIH小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)均购自美国ATCC公司。

细胞培养将NIH3T3与MEF细胞系置于含10%胎牛血清(体积分数)+100 U/ml青霉素+100 U/c链霉素的DMEM完全培养基中，于37℃、5% CO2条件下培养。

细胞与组织RNA的提取及去DNA处理对于贴壁生长的细胞，先用PBS洗细胞1～2次，然后按照每(5～10)×106个细胞:1 ml Trizol的比例直接将Trizol加入到细胞培养皿中；取新鲜鼠脑组织在液氮中研磨，制成1 mg组织:1 ml Trizol的比例，氯仿抽提，于-20℃异丙醇沉淀过夜，75%乙醇漂洗2次后，空气干燥，并加入适量DEPC处理过的水溶解。对提取的RNA进行去DNA处理所用的是RNase-Free DNase，具体为每消化10-3mg RNA用1个单位的RQ1 RNase- Free，37℃处理0.5 h，然后用异丙醇沉淀过夜，纯化RNA样品。

候选基因的选择和引物设计选择在皮层的一层或几层特异表达或者对皮层发育产生重要影响的63种基因(图1)，在北大生物信息学网站http://natsdb.cbi.pku.edu.cn/进行初筛，筛选出31个NAT阳性的基因，由于引物设计等原因本研究实际的扩增长度要小于转录本的长度(表1)。

RT-PCR本实验的总RNA来源分别是成年鼠脑组织，12.5 d胎鼠脑组织、MEF、NIH373，提取总RNA后，用链特异性引物(G)及随机引物(R)分别做逆转录并进行PCR反应，所用逆转录的引物均为PCR的下游引物。阴性对照的PCR体系中未加模板。

克隆测序31个逆转录产物都进行PCR检测，将得到的特异条带进行切胶回收，用DNA纯化试剂盒纯化，将纯化的DNA产物连接到pGEM-T 载体，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，送美国Invitrogen公司测序部进行测序，与原始序列比对一致的基因判定为NAT阳性基因 。

Ⅰ～Ⅵ：小鼠大脑新皮层第1层到第6层 ； SP：皮层下板Ⅰ-Ⅵ：layerⅠ-Ⅵ of mouse neocortex ；SP：subplate

表 1 生物信息学预测出的31个可能存在NAT的皮层发育相关基因

NAT：天然反义转录物
NAT: natural antisense transcript

结 果

RT-PCR验证和克隆测序结果显示，31个经生物信息学筛选的基因中，有8个验证正确(图2)。

M:PBR322-BstNI分子标记；G: 链特异性引物;R：随机引物;E12.5： 12.5 d胎鼠; MEF：小鼠胚胎成纤维细胞； 3T3： NIH小鼠胚胎成纤维M: PBR322-BstNI Marker；G:gene specific primer；R：random primer ；E12.5：mouse embryonic day 12.5; MEF：mouse embryonic fibroblast；3T3：NIH mouse embryonic fibroblast

讨 论

NAT为一种长的非编码RNA，是天然存在的反义RNA分子，在哺乳动物基因组中大多数NAT不能编码蛋白。Katayama等[2]用cDNA克隆大规模测序技术分析小鼠基因组(共43 553个转录元件)，发现与cDNA中互补链重叠且含有转录元件易于形成NAT的基因占全基因组的28.7%(12 519个)。非编码RNA形成了庞大的网络，对基因的表达调控起着至关重要的作用，对生物生长发育、疾病发生等生理过程具有广泛影响。Faghihi等[5]用大规模的RNAi技术在人类797个进化保守的NAT中筛选到7个对其编码基因有调控作用的NAT。目前研究表明，long non- coding RNA在神经干细胞命运决定、分化和表观调控中起到发挥了极其重要的作用[6]。NAT主要通过以下4种机制发挥作用：(1)转录调控相关机制；(2)在细胞核内的DNA-RNA相互作用；(3)细胞核中RNA-RNA相互作用；(4)在细胞质中的RNA-RNA相互作用[7]。本研究中的候选基因几乎涵盖了所有皮层特异表达的基因[8]，它们除了在皮层特异层次表达之外，在层次发生过程中也发挥了重要作用。例如：Lhx就在皮层发育两个相对独立方面发挥作用[9]，一方面它表达在室管膜区(ventricular zone, VZ)和室管膜下区(subventricular zone, SVZ)的前体细胞中，另一方面也表达在上层成熟的(有丝分裂后的)神经元中，提示其在前体细胞命运决定中起到决定作用，在上层神经元分化过程中也有一定功能，因为当敲除Lhx后所有层次的神经元均有缺失[10-11]。本研究选取了63个皮层发育相关的重要基因，经生物信息学预测出31个NAT可能为阳性的基因，筛选阳性的比例为49.2%，而验证后阳性为8个，验证阳性比率25.8%。8个重要NAT的发现为后续功能的研究提供了基础。为了进一步对NAT功能做探索，下阶段的工作是应用RACE，Northern blot等技术手段观察在在体水平各个NAT的表达情况，并深入探讨其分子机制。

[1] Lapidot M, Pilpel Y.Genome-wide natural antisense transcription:coupling its regulation to its different regulatory mechanisms[J].EMBO Rep, 2006, 7(12):1216-1222.

[2] Katayama S, Tomaru Y, Kasukawa T, et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome[J]. Science, 2005, 309(5740):1564-1566.

[3] Barrell BG, Air GM, Hutchison CA 3rd. Overlapping genes in bacteriophage phiX174[J]. Nature, 1976, 264(5581):34-41.

[4] Spigoni G, Gedressi C, Mallamaci A. Regulation of Emx2 expression by antisense transcripts in murine cortico-cerebral precursors[J].PLoS One, 2010, 5(1):e8658.

[5] Faghihi MA , Kocerha J, Modarresi F, et al. RNAi screen indicates widespread biological function for human natural antisense transcripts[J].PLoS One, 2010, 5(10):e13177.

[6] Mercer TR, Qureshi IA, Gokhan S, et al. Long noncoding RNAs in neuronal-glial fate specification and oligodendrocyte lineage maturation[J]. BMC Neurosci, 2010, 11:14.

[7] Faghihi MA, Wahlestedt C. Regulatory roles of natural antisense transcripts[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10(9):637-643.

[8] Molyneaux BJ, Arlotta P, Menezes JR, et al. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex[J]. Nat Rev Neurosci, 2007, 8(6):427-437.

[9] Alvarez-Bolado G, Rosenfeld MG, Swanson LW.Model of forebrain regionalization based on spatiotemporal patterns of POU-Ⅲ homeobox gene expression, birthdates, and morphological features[J]. J Comp Neurol, 1995，355(2):237-295.

[10] Bulchand S, Grove EA, Porter FD, et al. LIM homeodomain geneLhx2 regulates the formation of the cortical hem[J].Mech Dev, 2001, 100(2):165-175.

[11] Monuki ES, Porter FD, Walsh CA. Patterning of the dorsal telencephalon and cerebral cortex by a roof plate-lhx2 pathway[J].Neuron, 2001, 32(4):591-604.

ScreeningandIdentificationofNaturalAntisenseTranscriptinMouseCerebralCortex

LI Ping, ZHANG Jing, LI Ai-hua, WANG Shan, TAN Xiao-chao,YIN Bin, PENG Xiao-zhong

National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005, China

PENG Xiao-zhong Tel: 010-65295945，E-mail: peng_xiaozhong@163.com

ObjectiveTo screen and identify the possible existence of natural antisense transcript (NAT) within the mouse neocortex.MethodsSixty-three cerebral cortex layer-specific genes were screened by bioinformatics prediction in mice, among which 31 mice with potential NATs were screened. NAT was identified using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and then cloned in pGEM-T Vector System for sequencing.ResultsAmong 31 genes predicted using bioinformatics, 8 were proved to be NAT positive by RT-PCR.ConclusionsNATs exist in the mouse neocortex tissue during the development of cerebral cortex. NATs may influence mouse cortical development by regulating the related coding genes.

natural antisense transcript; mouse cerebral cortex; screening; identification

ActaAcadMedSin，2011，33(6)：620-623

彭小忠 电话：010-65295945，电子邮件：peng_xiaozhong@163.com

R739.41

A

1000-503X(2011)06-0620-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.007

国家自然科学基金(31071203)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(31071203)

2011-10-20)