顶空进样气相色谱法测定脑脉通软胶囊中有机溶剂残留量*

张在娟，逯 荻，崔丽霞，马 莉，任晓文

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.河南大学药学院，开封 475001；3.天津药物研究院，天津 300193）

脑脉通软胶囊原料提纯过程中用到大孔吸附树脂，可能带来有害的大孔树脂有机残留物，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅤⅢP残留溶剂测定法[1]和人用药品注册技术规范国际协调会（ICH）[2]，以及国家食品药品监督管理局药品注册管理对大孔树脂的最新要求，对于在生产工艺中使用过大孔树脂的原料或制剂，要对其可能带来的正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯有机残留溶剂进行检测，经查阅参考文献发现检测上述残留溶剂的方法主要是顶空进样法[3-9]。本实验就脑脉通软胶囊中有机溶剂残留量的测定方法进行了研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-6890N气相色谱仪，顶空进样器：Agilent 7694E,氢火焰离子检测器，色谱柱为DB-624石英毛细管柱（75m×0.530mm，df=3.00μm）。

1.2 试药 正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯均为分析纯，二甲基甲酰胺为分析纯，水为去离子水。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为DB-624石英毛细管柱（75m×0.530 mm，df=3.00 μm），载气为氮气，检测器温度为250℃，气化室温度为250℃，载气流速为15mL/min，柱温：程序升温，起始温度50℃维持18 min，以100℃/min的升温速率升至80℃，再以2℃/min的升温速率升至112℃，再以100℃/min的升温速率升至160℃维持10 min，再以100℃/min的升温速率升至200℃维持5 min。顶空进样条件：取实验溶液（配制方法见各具体项下）2 mL置10 mL顶空瓶中，加水2 mL，密封，摇匀（含供试品的加热振摇使供试品溶解）。90℃平衡40 min，进样时间1 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取苯10.0 mg置已盛有适量二甲基甲酰胺的10 mL量瓶中，振摇溶解，以二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀；分别精密称取正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯各10.0 mg置已盛有适量二甲基甲酰胺的50 mL量瓶中，振摇溶解，再精密量取上述配制的苯溶液1 mL置此量瓶中，以二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（1）。精密量取对照品溶液（1）5 mL置50 mL量瓶中，以二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（2）。

2.2.2 供试品溶液的配制 精密称取本品内容物2.00 g置10 mL顶空瓶中，精密加入二甲基甲酰胺2 mL，水2 mL，密封，置近沸水浴中加热振摇使供试品溶解，摇匀。

2.2.3 加样对照品溶液（回收率溶液）精密称取本品内容物2 g置10 mL顶空瓶中，精密加入对照品溶液2 mL，水2 mL，密封，置近沸水浴中加热振摇使供试品溶解，摇匀。

2.3 系统适应性与方法专属性 分别取正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和空白50%二甲基甲酰胺水溶液顶空进样，记录色谱图。

经计算各成分理论塔板数为正己烷31124、苯36688、甲苯 184390、二甲苯 229137（第 1 个峰）、苯乙烯257748、二乙烯苯679154。待测成分与相邻杂质峰的分离度均符合规定（R≥1.5）。

2.4 最小检测限 将对照品溶液（2）以二甲基甲酰胺稀释，精密量取稀释液2 mL置已盛有本品（091120批）内容物2.00 g的顶空瓶中，精密加入水2 mL，密封，置近沸水浴中加热振摇使供试品溶解，摇匀。按“2.1”项下色谱条件及顶空进样条件分别测定。结果各成分的最小检测限浓度为正己烷0.2 μg/mL，苯 0.3 μg/mL，甲苯 0.3 μg/mL，二甲苯1.6 μg/mL，苯乙烯 0.8 μg/mL，二乙烯苯 2.8 μg/mL。

2.5 标准曲线与线性范围 分别精密量取对照品溶液（1）2、3.5、5、7.5、10 mL 置 50 mL 量瓶中，以二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取2 mL置已盛有本品（091120批）内容物2.00 g的顶空瓶中，精密加入水2 mL，密封，置近沸水浴中加热振摇使供试品溶解，摇匀。按“2.1”项下色谱条件及顶空进样条件分别测定，扣除供试品溶液相应成分的峰面积（见供试品测定项下），计算。结果见表1。各成分回归方程相关系数均符合规定。

表1 回归方程及线性范围Tab.1 Regression equation and linear range

2.6 精密度实验 精密量取对照品溶液（2）与水各2 mL置10 mL顶空瓶中，密封，摇匀。按“2.1”项下色谱条件及顶空进样条件测定5次，得出结果为正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的相对标准偏差（RSD）分别为 5.6%、3.6%、3.4%、3.8%、3.2%、3.9%。

2.7 加样回收率 精密称取本品内容2.00g置10mL顶空瓶中，精密加入对照品溶液（2）2 mL，水2 mL，密封，置近沸水浴中加热振摇使供试品溶解，摇匀。按“2.1”项下色谱条件及顶空进样条件测定5次，所测峰面积扣除供试品中相应成分的峰面积（见供试品测定项下），以精密度实验项下各相应成分平均值为对照，进行计算，各成分回收率分别为正己烷30.8%，苯48.3%，甲苯37.3%，二甲苯27.4%，苯乙烯32.6%，二乙烯苯18.8%。结果见表2。

表2 加样回收率实验Tab.2 The results of the average recovery%

各成分的回收率在18.8%～48.3%之间，原因是基质的影响，为了消除其影响所以采用标准加入法（中国药典2010版二部附录32页）来计算残留物的含量。

2.8 重复性实验 回收率溶液也为标准加入法的>加样对照品溶液，所测峰面积扣除供试品中相应成分的峰面积（见供试品测定项下）进行计算，得出结果为正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的RSD分别为6.2%、5.9%、6.0%、5.1%、5.8%、6.4%，均符合要求。

2.9 溶液稳定性 精密称取本品内容物2.00 g置10 mL顶空瓶中，精密加入对照品溶液（2）2 mL，水2 mL，密封，置近沸水浴中加热振摇使供试品溶解，摇匀。按“2.1”项下色谱条件及顶空进样条件测定，其RSD分别为正己烷8.9%、苯3.3%、甲苯3.2%、二甲苯0.8%、苯乙烯1.9%、二乙烯苯0.5%，对照品溶液中各成分24 h之内均稳定。

2.10 样品测定 按“2.7”加样回收率测定项下加样对照品溶液及“2.2.2”项下供试品溶液的配制方法配制溶液。按“2.1”项下色谱条件及顶空进样条件测定，以加样对照品溶液各成分峰面积与供试品溶液各相应成分峰面积的差值为对照，外标法计算，即得。结果均未检出各残留成分。空白、对照品及样品色谱图见图1-3，样品测定结果见表3。

表3 各残留成分结果Tab.3 The results of the residual componentppm

3 讨论

3.1 溶解供试品溶剂的选择 选择溶剂既能溶解供试品，又能溶解待测成分，对测定且无干扰。经过实验供试品和待测成分在单一溶剂热二甲基亚砜、热二甲基甲酰胺中溶解较好，但二甲基亚砜对测定有干扰，二甲基甲酰胺作溶剂待测成分检测灵敏度较低；采用二甲基甲酰胺水混合溶媒作溶剂进行实验，结果发现水的比例提高，检测灵敏度随之提高，水的比例高于50%时，样品的溶解较差，在二甲基甲酰胺与水的比例为1∶1时，供试品既能溶解（热水浴中），待测成分又有适宜的检测灵敏度，且溶剂对测定无干扰，因此选择50%二甲基甲酰胺水溶液作为溶解供试品的溶剂。

3.2 水加入量对检测灵敏度的影响实验 分别精密称取供试品2.00 g置10 mL顶空瓶中，加入二甲基甲酰胺配制的对照品溶液（2）2 mL（浓度：2倍限量），分别加入不同量的水，密封，水浴加热振摇溶解，进行测定，结果见表4。结果发现二甲基甲酰胺溶液中水的加入，使待测成分检测灵敏度提高（对沸点高的成分，提高较多）。

表4 水加入量对检测灵敏度的影响实验结果Tab.4 The results of water addition on the detection sensitivity

3.3 色谱柱的选择 采用HP-INNOWAX（PEG20M）石英毛细管柱（30 m×0.53 mm，1.0 μm）为分析柱，以加样对照品溶液为样品，对柱温条件进行了筛选，结果正己烷、二甲苯始终不能与相邻杂质峰分离。采用DB-624石英毛细管柱（75m×0.530mm，df=3.00μm）为分析柱，以加样对照品溶液为样品，对柱温条件进行了筛选，结果在该毛细管柱条件下，待测成分与其相邻杂质峰均能很好分离。

3.4 柱温的选择 采用确定的DB-624石英毛细管柱（75 m×0.530 mm，df=3.00 μm）为分析柱，以加样回收率项下加样对照品溶液为样品，对柱温条件进行了筛选。结果表明在程序升温，起始温度60℃维持16 min，再以100℃/min的升温速率升至150℃，维持10 min，结果发现苯与其后相邻杂质峰不能很好分离。在起始温度50℃维持18 min，以100℃/min的升温速率升至80℃；再以2℃/min的升温速率升至112℃；再以100℃/min的升温速率升至160℃，维持10min；再以100℃/min的升温速率升至200℃，维持5 min；载气流速：15 mL/min。此条件下待测成分与其相邻杂质峰均能很好分离。

3.5 计算方法说明 将对照品溶液加到供试品中进行回收率实验，结果上述6种成分的回收率分别在18.8%～48.3%之间，所以采用标准加入法进行测定计算（将对照品溶液加到供试品中作为加样对照品溶液，以加样对照品溶液峰面积与供试品溶液峰面积的差值为对照，外标法计算供试品溶液中残留物的含量）。所测二甲苯为2个峰，按2峰之和计算，二乙烯苯为4个峰，按4峰之和计算（二甲苯、二乙烯苯多峰为异构体）。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社，2010：61－65.

[2]ICH指导委员会.药品注册的国际技术要求（质量部分）[S].北京：人民卫生出版社，2000：85－87.

[3]赵凤菊，来国防，程 宾.GC法测定七叶莲提取物中大孔树脂有机残留物[J].中国药事，2010，24（5）：438－440.

[4]宋利捷，郑 波，陈 新.顶空气相色谱法测定人参根皂苷中的大孔吸附树脂残留物[J].吉林大学学报（理学版），2011，49（2）：344－345.

[5]杨建刚，胡碧荣，张 琳，等.银杏胶囊中大孔吸附树脂有机残留物限量的方法学研究[J].西北药学杂志，2009，24（2）：96－97.

[6]贾存勤，屠鹏飞，李阳春，等.中药产品中大孔吸附树脂有机残留物检测方法研究[J].药物分析杂志，2006，26（4）：438－442.

[7]邵雷鸣，李 萌.顶空气相色谱法测定赤芍提取物中因大孔吸附树脂带入的有机残留物[J].医学信息，2010，23（3）：226－227.

[8]来国防，程 宾，周 兰，等.顶空GC法检测灯盏花素中大孔树脂残留物的量[J].河南大学学报（医学版），2009，28（2）：81－83.

[9]WANG SM,QIAN DG,WANG K,et al.Determination of the residues from microporous resin in traditionalChinesemedicine extractbyGC[J].Chin Pharm J,2009,44(1):55-58.