益气活血中药对心力衰竭大鼠MMP-1、TIMP-1影响的实验研究*

刘晓蕾 ，张 艳，礼 海

（1.辽宁中医药大学，沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032）

慢性心力衰竭（CHF）是指在静脉回流正常的情况下，由于心脏泵血功能发生障碍，心排血量减少，并导致组织灌注减少，肺循环和（或）体循环淤血的一组病理生理综合征[1]。新近研究发现，细胞外基质（ECM）合成与降解的失衡与心力衰竭发生密切相关[2]。而细胞外基质合成与降解的平衡又取决于基质金属蛋白酶（MMps）及其组织抑制因子（TIMps）的平衡[3]。益气活血复方是临床治疗慢性心力衰竭的经验方，用于防治慢性心力衰竭已取得较好的疗效[4]。本实验旨在观察益气活血复方对慢性心力衰竭大鼠心肌基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和基质金属蛋白酶特异性抑制物-1（TIMP-1）的影响。从基因和蛋白表达两方面，探讨该方对慢性心力衰竭的疗效机制和作用靶点，为中医药防治慢性心力衰竭提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 选择普通级10～12周龄健康SD大鼠60只，全部为雄性，体质量为200～230 g，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。

1.2 药物及试剂 益气活血复方：由黄芪、人参、红花、丹参、益母草、三七粉、葶苈子等组成，由本溪第三制药厂严格按其标准而成，处方中的全部药材均符合《中华人民共和国药典》2005年版有关规定。对照药赖诺普利片：由上海信谊万象药业股份提供，每片 10 mg，国药准字：H10960265。MMP-1，TIMP-1 PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司，试剂批号：（PRRS200707）。

1.3 主要仪器与器械 SONO S5500彩色多普勒超声机，由Agilnet公司生产；2583-I型内切式组织匀浆机,由浙江机械厂生产；实时荧光定量PCR仪7500型，美国Bioneer公司生产；AO石蜡切片机，由Scientifie instruments生产；MS-2000多媒体化生物信号记录分析系统，由广州市龙飞达科技有限公司生产。

2 实验方法

2.1 心力衰竭大鼠模型的制备 大鼠经10%水合氯醛0.005 mL/g腹腔麻醉后，背位固定，经喉气管插管术连接小动物呼吸机进行人工呼吸，频率每分钟50次，潮气量0.7～0.8 mL，胸部备皮，用针形电极刺入四肢及胸壁皮下与心电图机相连，描记正常心电图，消毒后在左侧第3、4肋间横向切开皮肤长约1.5 cm，钝性分离软组织，可见胸骨及肋软骨，并沿3、4肋间隙打开胸腔，用眼科小镊子轻夹心包膜，小剪子剪开心包膜暴露心脏，用镊子轻提左心耳，于左冠状动脉前降支起源点2～4 mm处用6号缝线结扎左冠状动脉主干，心电示波器显示胸前导联ST段及T波显著异常，重置心脏于胸腔，迅速分层用3号缝线缝合胸壁，并于伤口处敷以青霉素钠，待动物状态平稳后停人工呼吸。为大鼠口腔清痰，同时注射青霉素钠每日每次20万单位，持续3 d防止感染。常规喂养1周后，第2周将其饲料减1/2量，以使其饥饿，同时每天游泳至疲乏，每日1次，共4周。经多普勒超声心动图检测左室射血分数计算CI值≤180 mL/（min·kg）者为心力衰竭，列入观察对象。

2.2 实验分组及处理 将造模成功后的大鼠按随机数字表方法随机分为3组：模型组、中药组、西药组，空白对照组为未手术造模大鼠。由于在开始造模时造模技术不成熟，部分大鼠死亡，故空白对照组、中药组、西药组每组8只大鼠，模型组10只大鼠。空白对照组、模型组：不加任何药物处理因素，每日1次灌服同等体积的生理盐水；中药组：9.2 g/（kg·d）灌胃；赖诺普利西药组：1.5 mg/（kg·d）灌胃。前期笔者做了预实验，发现中药组以中剂量疗效最好，因此笔者本次实验以中剂量给动物用药。均用药6周。

2.3 各项指标检测 各组动物用药6周后，禁食不禁水12 h，在1%无戊巴比妥钠麻醉状态下，打开胸腔取出心脏，取其大鼠心脏心肌组织200 mg，并于液氮中冷冻后在-80℃条件下保存，利用实时定量荧光PCR技术和蛋白印迹分析法（Western blot）分别检测心肌组织中MMP-1、TIMP-1基因表达和蛋白表达。

2.4 统计学处理 实时定量PCR实验数据统计方法，采用相对定量方法计算。用2-△△CT（Livak）方法比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录之间的表达差异。本实验已对目的基因和内参基因的扩增效率进行了比对，其效率基本一致，故本研究中采用的此相对定量法进行。其计算公式如下：

计算 2-△△CT，其计算结果为实验样本表达比正常样本表达高出（或低出）的倍率。

应用SPSS 18.0版软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 益气活血复方对慢性心力衰竭大鼠心肌组织MMP-1表达的影响 结果见表1，图1。

表1 各组大鼠心肌组织MMP-1表达的情况（±s）Tab.1 The expression of MMP-1 in myocardial tissue of each group（±s）

表1 各组大鼠心肌组织MMP-1表达的情况（±s）Tab.1 The expression of MMP-1 in myocardial tissue of each group（±s）

注：与正常组比较，*P<0.01，#P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，##P<0.01；与中药组比较，△P＞0.05；▲P<0.05。

组别 n mRNA 蛋白空白对照组 81.000±0.00051.938±6.919模型组 102.671±0.838* 180.232±3.047#中药组 81.420±0.581** 90.387±6.606##西药组 81.555±0.432**△ 83.197±4.919##▲

图1 MMP-1蛋白表达的Western blot显色结果Fig.1 The result of Western blot for the protein expression of MMP-1

3.2 益气活血复方对慢性心力衰竭大鼠心肌组织TIMP-1表达的影响 结果见表2，图2。

表2 各组大鼠心肌组织TIMP-1表达的情况（±s）Tab.2 The expression of TIMP-1 in myocardial tissue of each group（±s）

表2 各组大鼠心肌组织TIMP-1表达的情况（±s）Tab.2 The expression of TIMP-1 in myocardial tissue of each group（±s）

注：与正常组比较，*P<0.01，#P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，##P<0.01；与中药组比较，△P<0.05，▲P<0.05。

组别 n mRNA 蛋白空白对照组 81.000±0.000181.455±12.688模型组 100.743±0.235* 73.543± 3.140#中药组 81.846±0.644** 153.817±12.178##西药组 81.518±0.460**△ 142.248±10.862##▲

图2 TIMP-1蛋白表达的Western blot显色结果Fig.2 The result of Western blot for the protein expression of TIMP-1

4 讨论

4.1 MMP-1、TIMP-1与慢性心力衰竭的关系 本实验发现，在模型组中，大鼠心肌组织中MMP-1的表达明显高于其他各组，而TIMP-1的表达明显低于其他各组。由此可见，模型组大鼠衰竭心肌组织存在着MMP-1和TIMP-1的失衡，因为TIMP-1表达的降低，MMP-1活性持续增高，使ECM的胶原蛋白大量降解继而导致心肌重构，促使心力衰竭的恶化。中药组和西药组中，MMP-1的表达较模型组明显降低，TIMP-1的表达较模型组明显升高，说明中西药治疗组的治疗可以降低MMP-1的表达，同时可以升高TIMP-1的表达，增强抑制MMP-1的作用，减少其对胶原的分解，从而达到降低MMP-1对心肌细胞外基质结构的破坏作用，使MMP-1、TIMP-1的比例达到平衡。

4.2 益气活血复方对慢性心力衰竭的影响 益气活血复方是基于认为气虚血瘀为慢性心力衰竭基本病机的基础上，结合临床经验用药，有效率达到86%以上。由人参、黄芪、丹参、三七、红花、益母草、葶苈子等组成。诸药配伍,具有强心利尿、标本同治之功。中医药有调节阴阳平衡，全面调整益气活血的作用。本研究显示，在中药组中，MMP-1和TIMP-1的表达较模型组比较呈反向变化，提示益气活血中药对MMP-1和TIMP-1起双向调节的作用即下调MMP-1的表达和上调TIMP-1的表达，从而使MMP-1、TIMP-1比例达到动态平衡。减少MMP-1对胶原的分解，使细胞外基质的生成和降解达到平衡，延缓心肌重塑，增加血管的顺应性，降低心室压力，改善心脏功能,从而阻止CHF的发展有关。与西药组比较，除在MMP-1蛋白表达中，西药组疗效优于中药组，其余各组中药组疗效均优于西药组，揭示了益气活血中药作用于慢性心力衰竭的疗效和作用靶点，为中医药防治慢性心力衰竭提供科学、客观的实验依据。

[1]礼 海，张 艳.强心通脉颗粒对慢性心力衰竭大鼠心肌组织AngⅡ及TXB2影响的实验研究[J].辽宁中医杂志，2009，36（10）：1802－1804.

[2]D Armient J.Matnx metalloproteinase disruption of extracelluar matrix and cardiac dysfunction[J].Trends Cardiovasc Med,2002,12(3):97-101.

[3]王凤鸣，王大为，秦玉明.基质金属蛋白酶与心力衰竭[J].实用儿科临床杂志，2005，20（11）：1149－1151.

[4]张云飞，礼 海，张 艳.强心通脉颗粒治疗慢性心力衰竭30例的临床研究[J].天津中医药，2010，27（6）：462-464.