滋肾调冲法对大鼠外周血内皮祖细胞影响的实验研究*

宋春敬，刘晓帆，孙艳明，李广斌，陈 静，李海霞，李瑞环，王 玲

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院，天津 300020；3.天津市胸科医院，天津 300051；4.天津市大港医院，天津 300270）

内皮祖细胞（EPCs）是内皮细胞的前体细胞。1997年Asahara等[1]最先研究发现成年个体外周血中存在骨髓来源的血管EPSs，能够参与生后血管再生过程。EPCs主要定居于骨髓，一般状态下外周血液中EPCs的数量很少，在月经和妊娠等生理状态下或血管损伤、组织缺血等病理状态下，EPCs能够被动员出骨髓，向外周血迁移，增加外周血中EPCs的数量，并进一步归巢到血管新生组织，形成新的血管。卵巢黄体是发生生理性血管新生少数几个成年组织之一，黄体血管新生与黄体功能密切相关，已有研究发现骨髓来源的EPCs参与黄体的血管新生[2]。滋肾调冲法是治疗黄体功能不全性功血的治疗法则，其代表方功血宁Ⅱ号方不仅明显改善临床症状，而且能够健全黄体功能[3-4]。补肾中药具有补骨填精益髓作用，使肾精充足，骨髓充盈，促进造血。因此可以认为，EPCs定居在骨髓，属骨中之髓，具滋肾调冲作用的功血宁Ⅱ号方可能有助于将骨髓中的EPCs动员出来向外周血迁移，进而参与黄体的血管新生。为此本研究以同种异体骨髓单个核细胞移植的假孕动物模型为研究对象，观察功血宁Ⅱ号方对动物外周血EPCs数量的影响，探讨其对骨髓EPCs的动员作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级Wistar雄性大鼠为供鼠，共48只，体质量200～220 g。清洁级Wistar雌性大鼠为受鼠，共174只，体质量180～200 g，由天津实验动物中心提供。

1.1.2 实验药物 功血宁Ⅱ号方组成：熟地黄15 g，山茱萸 10 g，山药 15 g，女贞子 15 g，枸杞子 15 g，当归 15 g，白芍 15 g，菟丝子 15 g，仙灵脾 15 g，香附10 g。购自天津中医药大学附属保康医院。乌鸡白凤丸，天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂产品，每丸9 g。批号：国药准字Z12020010。妊马血清促性腺激素（PMSG），宁波第二激素厂生产，兽药字（2006）110254564。人绒毛膜促性腺激素（HCG），上海生物化学制药厂生产，批号：0409013。

1.1.3 主要试剂 DMEM培养基；胎牛血清；大鼠淋巴细胞分离液，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；4，6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI），Sigma公司产品；免疫试剂Ⅰ抗工作液[含山羊抗大鼠CD133和CD34多克隆抗体（1∶50），其中CD34为藻红蛋白（PE）标记（CD34-PE）]，购自美国 Santa Cruz公司，Ⅱ抗工作液[含异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗山羊 IgG（1∶50）]，英国 ABCAM 公司产品。

1.1.4 主要仪器设备 400E型普通离心机；日本OLYPUS-BHT光学显微镜；LEIKA DM3000荧光共聚焦显微镜；德国Biofuge Fresco低温冷冻高速离心机；美国FACSCalibur流式细胞仪。

1.2 实验方法

1.2.1 骨髓单个核细胞的分离与标记 将供体雄性大鼠以颈椎脱臼法处死，于无菌条件下获取两侧股骨，用DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，加于大鼠淋巴细胞分离液之上，以2000 r/min离心20 min，吸取中间白色界面层，用磷酸盐（PBS）缓冲液洗涤2次，以1200 r/min离心10 min，制备骨髓单个核细胞悬液，计数。加入终浓度为50 mg/L的DAPI调整细胞浓度为（2～3）×1010/L。放入37℃培养箱中孵育45 min。在荧光显微镜下，观察细胞染色率＞90%，提示DAPI成功标记骨髓单个核细胞。

1.2.2 受体大鼠的预处理 受体大鼠饲养于SPF级实验室，每周以有效氯消毒鼠笼1次，经饲料、垫料均高温高压消毒。移植前3 d开始饮用含霉素（250 mg/L）和庆大霉素（32000 U/L）的无菌酸化水，持续至实验结束。照射前将大鼠卵巢部位用铅皮箍绑后，置于无菌透气的塑料瓶中，采用137Cs射线全身照射。照射剂量为7.5 Gy，剂量率为0.74 Gy/min。照射后6 h内，受体大鼠经尾静脉注入供鼠骨髓单个核细胞悬液 1 mL（2×107）。

1.2.3 动物分组及给药 将受体大鼠按随机数字表法随机分为移植对照组、功血宁Ⅱ号组和乌鸡白凤丸组，每组48只，另取未照射大鼠（30只）尾静脉输注等量培养液作为假孕对照组，共4组。参照“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表”，功血宁Ⅱ号方剂量为12.6 g/（kg·d）。中药煎煮30 min，共2次，合并煎液过滤，浓缩成浓度为1.3 kg/L的水煎剂，4℃保存备用。乌鸡白凤丸组给予乌鸡白凤丸，用蒸馏水配成混悬液，药物剂量为1.62 g/（kg·d），药物浓度为0.162 kg/L，骨髓移植后24 h开始给药，各组均按10 mL/kg灌胃给药。假孕对照组和移植对照组给予等容积的生理盐水。动物每日定时灌胃给药2次，连续给药至实验结束。

1.2.4 外周血象观察 无菌条件下采取移植第7天（+7d）、+15d大鼠眼内眦血，动态检测外周血象变化。

1.2.5 假孕大鼠模型的制备 受体大鼠于造血重建后，各组每只颈部皮下注射50 IU PMCG，48 h后每只皮下注射30 IU HCG，注射HCG 24 h后定为假孕第1天。

1.2.6 动物处理和标记细胞观察 在假孕第3、7、13天（相当于黄体早、中、晚期），各组分别处理存活的1/3大鼠，眼内眦球后静脉丛取血，血液涂片，即时荧光显微镜下观察DAPI标记骨髓单个核细胞在血液中的分布。

1.2.7 流式细胞仪检测外周血EPCs数量 采取大鼠眼内眦球后静脉丛血液1 mL于EDTA抗凝管中，加入PBS缓冲液1 mL混匀，加入淋巴细胞分离液中（2∶3），室温下 2400 r/min 离心 20 min，吸取中间白膜层，PBS缓冲液清洗3次，得到单个核细胞。取100 μL单个核细胞加入FITC标记的抗体CD133（间标）和CD34-PE，避光孵育10 min，同型抗体作阴性对照，加入含0、5%BSA的PBS缓冲液洗涤，室温1500r/min离心后加人500μL PBS（5%BSA）缓冲液上机分析。流式细胞仪分析200000个细胞，计数CD34-PE和CD133-FITC双阳性细胞数目，即内皮祖细胞数目。

1.2.8 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法进行检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠移植后生存情况 移植各组大鼠+1 d～+7 d一般状态正常，+7 d以后一般状态开始下降，各组均有动物出现不同程度的毛色杂乱，食欲减退，体质量下降等，移植对照组较功血宁组和乌鸡白凤丸组出现时间早且较为明显。+14 d一般状态好转。移植各组大鼠从+13 d至+20 d均有动物死亡。移植对照组存活率约为60%，余29只。乌鸡白凤丸组存活率约为64%，余31只。功血宁Ⅱ号组存活率约为71%。余34只。

2.2 大鼠移植后造血重建 移植各组大鼠+7 d外周血白细胞和血小板降至最低，15 d移植各组大鼠白细胞和血小板上升，基本恢复正常。

2.3 DAPI标记细胞在血液中的分布 DAPI在波长为358 nm的激发光作用下发出蓝色荧光。荧光显微镜下显示，移植各组大鼠黄体早、中、晚期血液涂片均可见核呈蓝色荧光的细胞，黄体早期数量多，功血宁Ⅱ号组尤为明显（见图1），假孕对照组未见核呈蓝色荧光的细胞。

图1 功血宁Ⅱ号组黄体早期血液涂片，可见核呈蓝色荧光的细胞Fig.1 Blood smear of early luteal stage in Gongxuening II group,in which cell with blue fluorescent nucleus can be seen

2.4 各组大鼠黄体早、中、晚期外周EPCs数目的比较 见表1。

表1 各组大鼠黄体早中晚期外周血EPCs数目比较（±s）Tab.1 Comparison of the number of peripheral endothelial progenitor cells of rats in early,middle and later luteal stage in each group（±s）个/20万个细胞

表1 各组大鼠黄体早中晚期外周血EPCs数目比较（±s）Tab.1 Comparison of the number of peripheral endothelial progenitor cells of rats in early,middle and later luteal stage in each group（±s）个/20万个细胞

注：与假孕对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与移植对照组比较，*P＜0.05；与功血宁Ⅱ号组比较，○P＜0.05；与同组早期比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与同组中期比较，●P＜0.05，●●P＜0.01。

组别 n 黄体早期 n 黄体中期 n 黄体晚期假孕对照组 1032.36±6.361028.40±5.721021.30±5.77▲▲●移植对照组 1038.20±7.711035.30±6.11△ 926.60±4.09▲▲●●功血宁Ⅱ号组 1146.10±7.72△△* 1240.70±5.76△△ 1131.10±7.49△△▲▲●●乌鸡白凤丸组 1139.0±7.87△○ 1037.73±6.60△△ 1028.09±6.56△▲▲●●

表1所示，各组外周血EPCs数目，黄体早期最多，中期略有减少，晚期明显减少，与早、中期相比均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。功血宁Ⅱ号组、乌鸡白凤丸组黄体各期EPCs数目均较假孕对照组显著增多（P＜0.05或 P＜0.01）；功血宁Ⅱ号组早期EPCs数目较移植对照组和乌鸡白凤丸组显著增多（P＜0.05）。

3 讨论

骨髓单个核细胞中存在许多种类的成体干细胞，EPCs是其中重要的一种。骨髓单个核细胞在体外经过培养，诱导后可向血管内皮细胞分化。移植骨髓单个核细胞能够归巢于缺血部位并表达成熟内皮细胞的表面标志，原因是与其中含有的EPCs引起的血管发生有关[5]。EPCs的识别主要依靠细胞表面标记，目前普遍认为CD34、CD133和VEGFR-2（Flk-1或KDR）是其基本表型特征，并以CD34+/CD133+或者CD34+/KDR识别EPCs。本研究在给受鼠大鼠移植骨髓单个核细胞后，以CD34+/CD133+作为EPCs的标记物，观察其外周血中CD34+/CD133+双标记细胞的数量变化。

骨髓中的EPCs经各种因素刺激后向外周血迁移，增加外周血EPCs的数量，称为EPCs的动员。组织的血管新生是重要的动员因素。黄体是成年个体发生血管新生的少数组织之一，无论是月经黄体还是妊娠黄体，在其新生血管形成的过程中，作为动员因素可增加外周血EPCs的数量。有研究表明，妊娠妇女外周血EPCs的数量在妊娠期明显增加[6]。

本研究观察到，假孕对照组在黄体早期EPCs数目最高，中期略有下降，至晚期明显减少，其变化与文献报道的强烈的血管新生发生在早黄体期，中期血管发育成熟和晚期血管退化相一致[7]，表明黄体生理性的血管新生对骨髓EPCs具有动员作用。

近年来研究发现许多中药对于EPCs具有动员作用，如黄芪、葛根素、丹参素等，补肾生血胶囊可通过动员骨髓EPCs的迁移、分化，促进局部血管新生，改善缺血组织供血[8]。

本研究结果表明，功血宁Ⅱ号组外周血EPCs数目在黄体各期均明显增多，早期尤为显著，表明具有滋肾调冲作用的功血宁Ⅱ号方能够将骨髓中的EPCs动员出来，增加外周血中的EPCs的数量。荧光显微镜下也观察到，DAPI标记的骨髓单个核细胞已从骨髓迁移进入了外周血，并可见功血宁Ⅱ号组黄体早期数量为多，可与外周血中的EPCs的数目变化相印证。

滋肾调冲法的>确立是根据黄体功能不全性功血的月经先期、经前淋漓出血等临床表现，认为其发病主要责之于肾虚，导致冲脉失调。冲脉为“十二经脉之海”，又为血海而主月经。而冲脉“注足少阴肾经的大络”，又与足少阴肾经在腹部并行，只有肾精充盈，方能使太冲脉盛、血海盈满，月事以时下，故有“经本于肾，旺于冲任二脉”之说。冲脉起始于胞宫，冲又有通之意，冲脉盛通，不仅可使月经规律来潮，也有助于生殖功能，故肾精充沛，冲脉盛通，可促进卵泡的发育、排卵及黄体功能的健全，而达到孕育的目的。功血宁Ⅱ号方以滋肾填精、养血柔肝、活血行气之品组成，经临床和实验研究表明，该方具有促进排卵和健全黄体功能的作用。本研究结果表明，功血宁Ⅱ号方能够动员骨髓EPCs至外周血中，提高循环血液中EPCs数量，对于EPCs进一步迁移、归巢至靶组织卵巢黄体，促进黄体血管新生具有重要作用。

[1]Asahara T,Mufobara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967.

[2]Asahara T,Masuda H,akahashi T,et al.Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization[J].Circ.Res,1999,85(3):221-228.

[3]哈孝贤，刘永志，董素芹，等.中药功(更)血宁I、II号冲剂治疗功血的临床研究[J].天津中医学院学报，1990，9（4）：23－29.

[4]王 玲，哈孝贤，张 远，等.功血宁对假孕大鼠黄体功能的影响[J].天津中医，2001，18（4）：31－33.

[5]Kocher AA,Schusiter MD,Szabolcs MJ,et al.Neovascularization of ischemic myocardium by human bone marrow derived angioblasts prevents eardiomyocyte apoptosis,reduces remodeling and improves cardiac function[J].Nat Med,2001，7(4)：430-436.

[6]Buemi M，Allegra A,D Anna R,et al.Concentration of circulating endothelial progenitor cells（EPC）in normal pregnancy and in pregnantwomenwithdiabetesandhypertension[J].J.AmJ Obstet Gynecol,2007，196（1）:68.

[7]Wulff C,Dicckson S E,Duncan W C,et al.Angiogenesis in the human corcup luteum:Simulated early pregnancy by HCG treatment is associated with both angiogenesis and vessel stabilization[J].Hum Reprod,2001,16(12):2515-2524.

[8]张喜成，何延政，李跃武，等.补肾生血胶囊动员骨髓内皮祖细胞促进缺血肢体血管新生的研究 [J].江苏中医药，2006，27（3）：57－58.