小半夏加茯苓汤含药血清对小鼠胚胎干细胞体外增殖及分化的影响*

宋殿荣 ，王雅楠 ，张 崴，朱 泽 ，郭 洁

（1.天津中医药大学第二附属医院妇科，天津 300150；2.天津医科大学，天津 300070；3.天津中医药大学，天津 300193）

小半夏加茯苓汤是《金匮要略》中经典止呕方剂，能够散饮降逆，和胃止呕，治疗“妊娠恶阻”疗效显著。半夏可否用于妊娠期疾病的治疗，是医家们争论的焦点。本课题组前期实验表明，清半夏含药血清无明显胚胎毒性。本实验通过体外细胞培养，进一步观察小半夏加茯苓汤含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的影响，综合评价其胚胎毒性，为该方在妊娠期的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物 健康未交配过的Wistar雄鼠30只，体质量（230±10）g，许可证编号：SCXK（津）2009-0001。天津中医药大学实验动物中心适应性饲养3 d后进行实验。其中10只灌服小半夏加茯苓汤水煎液、10只灌服清半夏水煎液、10只灌服生理盐水做对照。

1.2 药物 小半夏加茯苓汤组成：清半夏18 g，生姜15 g，茯苓9 g，制备成含生药1 kg/L。清半夏18 g，制备成水煎液含生药0.5 kg/L，由天津中医药大学第二附属医院提供。参考《药理实验方法学》[1]与《实验动物学》[2]，给药剂量=临床常用量×动物等效剂量系数×培养基内的稀释度，即动物等效剂量×培养基内的稀释度。大鼠（200 g）与人（70 kg）之间等效剂量系数为6.3，培养基内的稀释度为5（体外反应系统中含药血清添加量按20%计算），最终给药剂量小半夏加茯苓汤组为18.9g/（kg·d）、半夏组为8.1g/（kg·d）。等体积灌服生理盐水，连续给药3 d，末次灌胃后1～2 h腹主动脉取血，静置离心，灭活滤菌，保存备用。制备小半夏加茯苓汤含药血清、清半夏含药血清和空白血清。

1.3 细胞 鼠胚成纤维细胞（MEF）和胚胎干细胞-D3（ES-D3）购自中国科学院上海生命科学研究院生化细胞研究所。

1.4 主要试剂 DMEM高糖培养基、胰蛋白酶购自英国GIBCO公司，胎牛血清（FBS）、β-巯基乙醇（β－ME）、非必需氨基酸（NEAA）、明胶、丝裂霉素 C、白血病抑制因子（LIF）、噻唑蓝（MTT）均购自Sigma公司。总RNA提取试剂盒（TIANGEN DP419），cDNA第一链合成试剂盒（TIANGEN KR104），2×Taq PCR MasterMix试剂盒（TIANGEN KT201）。

1.5 ES细胞的体外培养[3]取出液氮中的ES细胞株进行细胞复苏，接种于备用的MEF饲养层，加入内含 20%FBS、0.1mmol/Lβ-ME、1%NEAA 及 1×106U/L的LIF维持培养。为保持其理想的未分化状态，当胚胎干细胞团集落达到60%～70%融合时，即需传代。

1.6 MTT比色法测定细胞活性 消化ES细胞，差速贴壁后用含20%FBS的培养液配成单细胞悬液，以500个/孔的细胞接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后，吸弃培养液，分为 A、B、C、D组，分别加入含有20%小半夏加茯苓汤含药血清的培养液（A组）、含有20%清半夏含药血清的培养液（B组）、含有20%空白血清的培养液（C组）及含有20%FBS的培养液（D组），终体积为100 μL。每组共设6个平行孔。继续培养 24、48、72、96 h，每孔加入 20 μL MTT溶液（5 g/L），5%CO2、95%湿度、37℃继续培养4 h，终止培养。小心吸弃培养液上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振荡10 min显色。待沉淀完全溶解后，用波长为630 nm的酶联免疫检测仪测定其吸光度（OD）值。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.7 ES细胞分化培养—悬滴—悬浮—贴壁[4]收集ES细胞分别加入A、B、C、D 4种培养液吹打，制成单细胞悬液，调整细胞密度至3.75×107个/L，分组同上。取每滴20 μL的单细胞悬液，以80滴/培养皿置于10cm细菌培养皿内盖上，将皿盖翻转至正常位置，培养皿内加入PBS于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内3 d。每个悬滴内均含有1个干细胞团，即拟胚体（EB）。吸取 PBS，分别加入 A、B、C、D 培养液，45°角拿取培养皿盖子，将EBs冲入培养皿底，轻晃培养液，使EBs悬浮于培养液中，置培养箱培养2 d。吸取EB分别接种至事先用明胶包被的24孔板内，轻轻振动，使EB置于孔中央，置培养箱培养5 d。观察24孔板内可见ES细胞分化成为具有收缩能力的心肌细胞，进行ES细胞分化能力检测。

1.8 半定量逆转录-聚合酶链氏反应（RT-PCR）法检测心肌细胞特异基因（β-MHC）的表达 提取细胞总RNA，进行浓度和纯度的鉴定，逆转录合成cDNA第一链后PCR扩增。肌球蛋白重链基因（β－MHC）为ES细胞中分化的心肌细胞特异表达基因，GAPDH为内对照管家基因，目的基因和管家基因的引物经NCBI BLAST检索无显著同源性序列，具体引物序列和扩增片断长度见表1。PCR反应体系为：Template 2 μL，Forwardprimer（10 μmol/L）2.0 μL，Reverseprimer（10μmol/L）2.0 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O补至50 μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，72℃延伸5 min。

表1 β-MHC和GAPDH引物序列和扩增片断长度Tab.1 Primer sequences and amplified fragment length of β-MHC and GAPDH

1.9 PCR产物的凝胶电泳和半定量分析 取5 μL扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察，缓冲液为0.5×TBE，电压为100 V，电泳30 min后紫外灯下观察结果。采用Image-Pro Plus 6.0软件对电泳条带进行灰度扫描，得到相应的光密度值，求出各组目的条带的光密度比值（ODMHC/GAPDH）。

1.10 统计学处理 采用SPSS 14.0统计软件包分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对ES增殖的影响 在连续培养24、48、72、96h，小半夏加茯苓汤含药血清培养的ES细胞增殖迅速，在细胞数量和活性方面均与FBS、空白血清、清半夏含药血清相似，表明小半夏加茯苓汤含药血清对ES生长无抑制作用，见表2。

2.2 对ES分化的影响 小半夏加茯苓汤含药血清培养下的ES细胞分化程度和分化为心肌细胞特异基因β-MHC的表达水平，与清半夏含药血清、空白血清和FBS组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。其灰度比值MHC/GAPDH接近于1，表明小半夏加茯苓汤含药血清对胚胎干细胞向心肌分化无抑制作用，见图1和表3。

表2 小半夏加茯苓汤含药血清对ES增殖的影响（±s，n=6）Tab.2 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoction-containing serum on the proliferation of ESCs（±s，n=6）

表2 小半夏加茯苓汤含药血清对ES增殖的影响（±s，n=6）Tab.2 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoction-containing serum on the proliferation of ESCs（±s，n=6）

注：与各组比较，△P>0.05。

?

图1 小半夏加茯苓汤含药血清对ES分化为心肌β-MHC表达的影响Fig.1 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoctioncontaining serum on the β-MHC mRNA of cardiac myoblasts differentiated by ESCs

表3 小半夏加茯苓汤含药血清对ES分化为心肌β-MHC表达的影响（±s，n=6）Tab.3 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoctioncontaining serum on the β-MHC mRNA expression of cardiac myoblasts differentiated by ESCs（±s，n=6）

表3 小半夏加茯苓汤含药血清对ES分化为心肌β-MHC表达的影响（±s，n=6）Tab.3 Effect of Xiaobanxia added Fuling decoctioncontaining serum on the β-MHC mRNA expression of cardiac myoblasts differentiated by ESCs（±s，n=6）

注：与各组比较，△P>0.05。

?

3 讨论

有关半夏毒性的研究屡有文献报道，但经炮制或配伍后其毒性是否有所改变，历代医家说法不一。本课题前期研究结果显示炮制后的清半夏无明显胚胎毒性。半夏与生姜配伍是出自《金匮要略》之中医止吐祖方——小半夏汤。半夏与生姜均有降逆止呕、和胃化痰之功，合用相须起协同增效作用，对痰饮滞中、胃失和降的呕吐效果尤佳，医圣张仲景将两者合用创小半夏汤治“诸呕吐，谷不得下者”，成为治呕之祖剂，并在此方基础上加入淡渗利水、宁心益脾的茯苓以针对饮邪深重、甚则凌心蔽阳的呕吐证而制成小半夏加茯苓汤，成为治本澄源、治湿痰留饮之主方。

胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出来的具有多向分化潜能的细胞，其分化过程能够在分子水平重演胚胎发育过程，为哺乳动物的生殖发育毒理等方面的研究提供了非常有价值的体外实验基础。该实验按临床常用制半夏配伍之小半夏加茯苓汤作为研究对象，通过胚胎干细胞实验，研究小半夏加茯苓汤对胚胎干细胞增殖和分化的影响，结果表明小半夏加茯苓汤含药血清对ES增殖和分化为心肌细胞特异性基因β-MHC的表达均无抑制作用，提示该实验剂量下未见胚胎发育毒性。

该实验采用含药血清作为受试物，观察药物对细胞的影响，研究中药的胚胎毒性，考虑了药物的体内代谢过程，对临床应用具有指导价值。该课题还将进一步对血清中的含药成分进行定性、定量检测，为半夏及小半夏加茯苓汤的胚胎毒性研究提供更准确数据。

[1]刘建文.药理实验方法学新技术与新方法[M].北京：化学工业出版社，2004：258－261.

[2]孙敬方.实验动物学[M].北京：人民卫生出版社，2004：150－194.

[3]Eisenbrand G，Baker V.Methods of in vitro toxicology[J].Food Chem Toxicol,2002,40(2-3):193-236.

[4]Chen R，Chen J，Cheng S，et al.Assessment of embryotoxicity of compounds in cosmetics by the embryonic stem cell test[J].Toxicol Mech Methods,2010,20(3):112-118.