乳酸菌表层蛋白的分离及其结构和性质*

朱晓，胡斌，李景艳，刘慧博，卢蓉蓉

(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

乳酸菌表层蛋白的分离及其结构和性质*

朱晓，胡斌，李景艳，刘慧博，卢蓉蓉

(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

对自主拥有的多株乳酸菌进行了表层蛋白的分离和鉴定，并对其结构和性质进行了研究。采用LiCl溶液进行提取，经SDS-PAGE检测，确定嗜酸乳杆菌fb116、嗜酸乳杆菌fb115和瑞士乳杆菌fb213携带表层蛋白。采用差示扫描量热仪(DSC)测定，其变性温度分别为63.67℃，61.98℃和59.78℃。它们的氨基酸组成大致相同，疏水氨基酸含量高达45%，酸性氨基酸含量在21%左右，远高于碱性氨基酸。圆二色谱法(CD)分析显示，其二级结构相似，α-螺旋和β-折叠约占34%和12%。去除表层蛋白之后，3株菌株的自动聚集能力和表面疏水性出现下降，这提示表层蛋白的存在有助于乳酸菌黏附性能的发挥。

乳酸菌，表层蛋白，二级结构，表面性质，氨基酸组成

大多数细菌细胞壁的表面存在次晶格阵列结构，透明、匀称、高度多孔且孔径均一。这层表面结构以非共价键与细胞壁结合，通常能用促溶剂盐酸胍和离解剂LiCl溶液溶解成蛋白单体——表层蛋白(surface layer proteins)，其分子质量为40～200 ku。在细菌细胞总蛋白中，表层蛋白的含量高达10% ～15%。除去提取剂后，表层蛋白本能地重新组装成次晶格阵列结构。目前认为，表层蛋白具有保护和决定细胞形态、分子、离子肼和胞外酶的结合位点、细胞黏附和表面识别以及作为病原菌的毒力因子等功能［1］。

乳酸菌表层蛋白分子质量仅为25～71 ku，是分子质量最小的一类表层蛋白，其等电点 pI为9.4～10.4，这是它们区别于其他表层蛋白的典型特征。表层蛋白具有多样性，目前，只有少数表层蛋白的氨基酸序列是已知的［2-4］，对其功能了解也较少。有些乳酸菌的表层蛋白对其表面性质有一定影响，并与它们黏附肠上皮细胞和细胞外基质有关［5-10］。

在发酵食品(如泡菜、豆豉和酸乳)中存在着多种乳酸菌。乳酸菌是公认的益生菌，近几年在食品工业上得到了高度关注。由于乳酸菌和表层蛋白具有多样性和差异性，本文旨在从自主拥有的乳酸菌资源平台中发掘携带表层蛋白的乳酸菌，研究这些表层蛋白的结构和性质，探讨它们在乳酸菌益生性质中发挥的作用机制，为这些乳酸菌的实践应用提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 菌种

嗜酸乳杆菌fb115(Lactobacillus acidophilus fb115)、嗜酸乳杆菌 fb116(Lactobacillus acidophilus fb116)、瑞士乳杆菌 fb213(Lactobacillus helveticus fb213)、干酪乳杆菌 fb34(Lactobacillus casei fb34)、植物乳杆菌N34(Plant lactobacillus N34)、植物乳杆菌N29(Plant lactobacillus N29)、两歧双歧杆菌fb35(Bifidobacterium bifidum fb35)、鼠李糖乳杆菌 fb36(Lactobacillus rhamnosus fb36)，由江南大学食品学院食品生物技术研究中心提供。

1.2 培养基

MRS液体培养基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖40 g/L，乙酸钠10 g/L，无水MgSO40.048 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，柠檬酸氢二铵 2 g/L，KH2PO4·3H2O 2.68 g/L，吐温 80 2.0 mL/L，pH 6.2 ～6.4;MRS 固体培养基:在 MRS 液体培养基的基础上添加琼脂粉15 g/L。

1.3 试剂

SDS-PAGE低分子质量标准蛋白Marker(14.4～97.4 ku)，中科院上海生物化学研究院;牛血清清蛋白，上海华美生物工程公司;0.22 μm混合纤维素滤膜，上海兴亚净化材料厂;透析袋，截留分子质量14 ku，上海绿鸟科技有限公司;其它试剂均为分析纯。

1.4 仪器与设备

Minispin plus高速离心机，德国EPPENDORF公司;Avanti J-26 XP高速冷冻离心机，BECKMAN COULTER公司;DKY-II恒温调速回转式摇床，上海杜科自动化设备有限公司;GRP 9160隔水式恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司;DYY-IIB三恒电泳仪，北京市六一仪器厂;GelDoc XR System凝胶成像系统，美国Bio-rad伯乐公司;UV-1100

紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司;6 L落地式冻干机，美国LABCONCO公司;DSC-7差示扫描量热仪，Perkin Elmer公司;SYNAPT MS液相色谱串联质谱仪，美国WATERS公司。

1.5 实验方法

1.5.1 菌株的活化和传代

将已活化的乳酸菌转接于MRS液体培养基中，接种量为20 mL/L。于37℃恒温培养18 h至对数末期，传接3代，留取第3代的菌液。离心(5 000 r/min，4 ℃，15 min)收集菌体，用0.01 mol/L 无菌的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.2)重悬洗涤2次，制备菌悬液备用。

1.5.2 菌体全蛋白和表层蛋白的提取

参考Garrote等［11］的方法并作适当改动。离心(5 000 r/min，4 ℃，15 min)收集菌体，加入1/10 体积的10 g/L SDS溶液，混匀，煮沸10 min。离心(12 000 r/min，4℃，15 min)收集上清液，得到菌体全蛋白提取液，于4℃下保存备用。

提取表层蛋白时，收集菌体后，用1/10体积的5 mol/L LiCl溶液，在37℃、180 r/min的摇床中处理60 min，再进行离心。其他处理方式同上。取部分上清液于透析袋中，每2 h换水1次至完全透析。冻干。冻干物保存于-20℃，备用。

1.5.3 SDS-PAGE 电泳分析

分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，起始电压80 V，溴酚蓝前缘进入分离胶后150 V，进行蛋白质考马斯亮蓝R-250染色。鉴定实验菌株是否携带表层蛋白。

1.5.4 表层蛋白的变性温度分析

采用差示扫描量热仪(DSC)进行分析［12］。称取2～4 mg蛋白质冻干物于铝盒中压片，记录样品质量。设定温度区间为30～130℃，升温速率为10℃/min。

1.5.5 表层蛋白的氨基酸组成分析

采用酸水解法，利用液相串联质谱法(LC-MS)测定除色氨酸以外的氨基酸含量。

1.5.6 表层蛋白的二级结构分析

采用圆二色谱法。样品浓度:0.01～0.2 g/L，扫描波长范围:190～250 nm，扫描速率:100 nm/min，光程:l mm。扫描平行3次。

1.5.7 菌株自动聚集能力分析

参考Chen等人［13］的方法，并作适当改动。调整菌悬液浓度至约108CFU/mL。取2 mL上层菌悬液，混匀15 s，室温下放置4 h后测定600 nm吸光度。自动聚集能力百分比计算公式:

式中:A0表示最初菌悬液在600 nm的吸光度;A4表示4 h时菌悬液在600 nm的吸光度。

1.5.8 表面疏水性分析

参考Kos等人［8］的方法，并做适当修改。调整菌悬液浓度至约108CFU/mL，测定其在600 nm下的吸光度，记为A0。取3 mL调整浓度后的菌液，加入1 mL二甲苯，振荡5 min，静置30 min，等待分层。取水相，在600 nm下测定A1。细菌细胞表面疏水性计算公式:

式中:A0表示最初菌悬液在600 nm的吸光度;A1表示分层后水相菌悬液在600 nm的吸光度。

1.6 数据处理方法

文中数据为3次平行测定值的平均值。显著性分析采用SPSS 16.0○R(美国 SPSS公司)的单因素方差分析(One-Way ANOVA，Turkey)在显著性水平P=0.05下进行数据分析与统计。

2 结果和讨论

2.1 携带表层蛋白的乳酸菌的初筛

根据报道，嗜酸乳杆菌表层蛋白分子质量在41～49 ku［1，14-15］，瑞士乳杆菌表层蛋白分子质量在 43 ～52 ku［9，16-17］左右。由图 1 和图 2 可以看出，分子质量40～70 ku内，只有嗜酸乳杆菌fb115、嗜酸乳杆菌fb116以及瑞士乳杆菌fb213的LiCl提取物和SDS提取物在45～66 ku内有主要的蛋白条带，均大于45 ku，可判断这3株乳杆菌携带表层蛋白。

2.2 表层蛋白的热变性温度

嗜酸乳杆菌fb116、嗜酸乳杆菌fb115和瑞士乳杆菌fb213的表层蛋白冻干物的DSC分析图谱分别见图3，这3种表层蛋白的变性温度 Tm分别为(63.67 ±0.28) ℃，(61.98 ± 0.67) ℃ 和(59.78 ±0.85) ℃。

图3所示，3株乳杆菌表层蛋白的DSC曲线均只出现了1个吸热峰，峰形较为对称。相比有些乳酸菌的表层蛋白有2个变性温度，一个在57～70℃，一个在98～118℃［12］，3株乳杆菌的表层蛋白的热变性温度比文献报道值略低，这与表层蛋白的二级结构、相对分子质量、轻重链长度比例以及氨基酸组成等因素有关。这进一步验证了不同菌株之间表层蛋白的差异性。

图1 LiCl提取表层蛋白和SDS提取细胞全蛋白的SDS-PAGE图谱

图2 LiCl提取表层蛋白和SDS提取细胞全蛋白的SDS-PAGE图谱

图3 3株乳酸菌表层蛋白的DSC热变性图谱

表1 3株乳酸菌表层蛋白的氨基酸组成 %

2.3 表层蛋白的氨基酸组成

蛋白质的氨基酸组成影响着蛋白质的结构和热稳定性等理化性质以及功能。3株乳酸菌的表层蛋白冻干物的氨基酸组成结果分别如表1所示。

由表1可知，3株乳酸菌的表层蛋白的氨基酸组成大致相近:带羟基氨基酸含量达15%左右;疏水氨基酸含量高达45%左右，稍高于表层蛋白的平均水平［1］;酸性氨基酸含量在21%左右，远高于碱性氨基酸;碱性氨基酸中赖氨酸含量最高，达8% ～10%;组氨酸、精氨酸和蛋氨酸含量也较低，半胱氨酸几乎没有。高含量的酸性氨基酸使乳酸菌表层蛋白的等电点pI偏碱性。此外，含硫氨基酸含量很低，推测这3种表层蛋白的二硫键很少，维持其结构稳定的作用力则主要为非共价键。

2.4 表层蛋白的二级结构

表2显示，3株乳酸菌的表层蛋白的二级结构组成具有高度的相似性;均表现为α-螺旋和无规则卷曲的含量较高，α-折叠和 β-转角所占的比例较低。据文献报道［1］，乳酸菌表层蛋白平均大约有20%的氨基酸形成了α-螺旋，40%形成β-折叠，而形成的无规卷曲和α-转角结构则在5% ～45%之间变化。3株实验菌株的表层蛋白的二级结构中，结构最稳定的β-折叠的含量较文献报道［1，12］的偏低，而 α-螺旋含量较文献报道［1，12］要高出很多，这种二级结构的比例组成恰能说明3株乳酸菌的热变性温度比文献报道的偏低，低含量的β-折叠使蛋白质更容易在较低的温度下热变性。

此外，α-螺旋、β-折叠的比例与氨基酸组成有关。通常，高含量的谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸有利于α-螺旋的形成，而缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸则有利于形成β-折叠。以瑞士乳杆菌fb213的表层蛋白为例，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸含量之和为21.77%，高于缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸的含量之和17.52%，这可以部分解释其α-螺旋多于β-折叠的现象。另外两种表层蛋白也类似。

表2 3株乳杆菌的表层蛋白的二级结构

2.5 表层蛋白对菌株表面性质的影响

乳酸菌表面性质中的表面疏水性和自动聚集能力通常被认为是两个独立、能够反映菌株黏附能力的特征。

2.5.1 表层蛋白对菌株自动聚集的影响

自动聚集是微生物之间的相互作用，对于一些益生菌来说，自动聚集是黏附肠上皮细胞或与病原菌共聚集形成保护屏障而阻止病原菌的第一步［18］，测定去除表层蛋白前后菌株自动聚集能力的变化可验证它们是否参与了这一过程［19］。如表3所示，经过5 mol/L的LiCl溶液处理之后，破坏了菌体的表层，去除了大量表层蛋白之后，3株实验菌株的自动聚集能力大约下降了12% ～23%。这表明，表层蛋白或完整的表层参与了菌体细胞的自动聚集过程，进而可能参与了菌体细胞的对肠上皮细胞的黏附，使得菌株得

以定植于肠道，抑制病原菌的黏附。

2.5.2 表层蛋白对菌株表面疏水性的影响

嗜酸乳杆菌fb116、嗜酸乳杆菌fb115和瑞士乳杆菌fb213经LiCl处理、去除表层蛋白前后，菌株的表面疏水性变化见表3。嗜酸乳杆菌fb115和瑞士乳杆菌fb213在去除表层蛋白之后，其表面疏水性显著下降，表明它们的表层蛋白对菌株的表面疏水性有所贡献。疏水性的强弱主要取决于细菌表面非极性基团的多少，与脂磷壁酸等结构也有关。嗜酸乳杆菌fb116在去除表层蛋白之后，其表面疏水性反而升高，可能因为除去表层蛋白后裸露的细胞壁表面疏水性更强。这也体现了表层蛋白的菌株特异性。表层蛋白影响了菌株的表面疏水性，后者与菌株的黏附能力相关［20］。初步推断，嗜酸乳杆菌fb115和瑞士乳杆菌fb213的表层蛋白可能影响菌株的黏附性质。

表3 菌株的表面性质分析

3 结论

从自主拥有的乳酸菌资源平台中筛选了3株携带表层蛋白的乳杆菌，分别为嗜酸乳杆菌fb116、嗜酸乳杆菌fb115和瑞士乳杆菌fb213。3种表层蛋白的变性温度分别为 63.67，61.98，59.78 ℃。它们的氨基酸组成大致相同，二级结构也具有高度的相似性，α-螺旋和β-折叠约占34%和12%，无规则卷曲约占33%，结构较为松散，导致变性温度较低。鉴于菌株的表面性质与黏附性质的强相关性，初步推测，这3株乳酸菌的表层蛋白可能与其黏附性质也有关，利于菌株益生功能的发挥。

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Surface Layer Proteins of Lactobacillus:Isolation，Structure and Properties

Zhu Xiao，Hu Bin，Li Jing-yan，Liu Hui-bo，Lu Rong-rong
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

In the present study several lactobacillus carrying surface layer proteins had been screened from those owned by our laboratory.They were Lactobacillus acidophilus fb116，Lactobacillus acidophilus fb115 and Lactobacillus helveticus fb213.The thermal analysis of the lyophilized surface layer proteins were performed by differential scanning calorimetry(DSC).DSC analysis showed one phase transition with maxima located at ca.63.67℃，61.98 ℃and 59.78 ℃ for these three proteins.The amino acid compositions of the three proteins were determined mostly the same，which had a high content(45%)of hydrophobic amino acids and a higher content(24%)of acidic amino acids then basic ones.By circular dichrosim(CD)spectra the secondary structures of the proteins were predicted to be composed similarly of 34%alpha-helix and 12%beta-sheet.After removal of surface layer proteins，the autoaggregation percentage and the cell surface hydrophobicity of the three lactobacillus were reduced.It was implied that the surface layer proteins played a role in adhesion property of Lactobacillus.

Lactobacillus，surface layer proteins，secondary structure，surface properties，amino acid composition

硕士(卢蓉蓉教授为通讯作者，E-mail:lurr@jiangnan.edu.cn)。

*教育部新世纪优秀人才计划(NCET-09-0436);国家自然科学基金(No.31071491)

2011-07-26，改回日期:2011-08-07