pH吸附法纯化乳酸乳球菌素Lacticin LLC518*

方佳琪，竺德强，柯芳芳，陈晓琳，张明

(安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥，230036)

pH吸附法纯化乳酸乳球菌素Lacticin LLC518*

方佳琪，竺德强，柯芳芳，陈晓琳，张明

(安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥，230036)

对乳酸乳球菌素Lacticin LLC518在不同pH条件下产生菌的吸附作用进行研究，结果表明，pH 6.0时吸附率达100%，pH 2.0时吸附率为0。利用该特性，可将产生菌细胞从发酵液中分离，制备Lacticin LLC518粗制品。通过与硫酸铵沉淀样品进行对照，表明pH吸附法具有良好的分离效果，Lacticin LLC518的回收率为20%，纯化倍数高达83.02。

乳酸乳球菌素，pH吸附，分离，层析技术，效率

细菌素是一些细菌产生的具有抑菌生物活性的蛋白质类物质，一般抑制与产生菌同种的其它菌株或亲缘关系相近的菌株［1］，但有些可以抑制亲缘关系较远的菌株甚至霉菌［2］。细菌素由于可被人类肠胃道分泌的蛋白酶降解，对人体无毒副作用，因而在食品工业中可作为食品的保鲜剂，乳酸链球菌素Nisin就是目前广泛应用于食品保鲜的细菌素［3］。

在食品工业中，广泛使用膜过滤和喷雾干燥技术制备食品保鲜用途的细菌素［4］，而在理论研究中多采用硫酸铵沉淀和各种层析技术相结合的多步法纯化样品［5－6］。1992 年 Yang等［7］研究了 Nisin 等 4 种细菌素的吸附性能，发现这些细菌素对产生菌的最适吸附和解吸附pH值分别在6.0和2.0附近。研究表明，细菌素产生菌一般都能吸附其产生的细菌素分子［8］，吸附和解吸附的特性基于细菌素的带电特性，且易受到各种盐类及有机试剂的影响［9－11］，但是在吸附的过程中是否具有选择性，尚未见报道。本文以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)LLC518对所产细菌素Lacticin LLC518的吸附和解吸附作用为基础，以硫酸铵沉淀样品为对照，利用各种层析技术对比分析pH吸附法的有效性，为该细菌素的进一步纯化和在食品工业中的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

指示菌乳杆菌(Lactobacillus sp.)LPX801和乳酸菌素Lacticin LLC518产生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)LLC518均为本实验室筛选所得。

1.1.2 培养基

指示菌及细菌素产生菌的培养基均为MRS培养基［12］。

1.1.3 主要试剂与仪器

Sephadex G－50(GE)，三氟乙酸(Sigmaaldrich)，乙腈(山东禹王实业有限公司化工分公司)，硫酸铵(生工生物工程上海有限公司)，其它试剂均为分析纯。

Aglient－1100反相高效液相色谱，Aglient;TH－500梯度混合器、HL－2横流泵、电脑核酸蛋白检测仪、电脑全自动部分收集器，上海青浦沪西仪器厂;FD－1真空冷冻干燥机，北京东南仪诚设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸乳球菌素Lacticin LLC518活性及效价的测定

采用打孔法［13］测定Lacticin LLC518的活性，将OD600为1.5的乳杆菌LPX801菌悬液280 μL加入到已熔化并冷却至50℃的30 mL MRS固体培养基中，混匀倒平板，待凝固后以直径7 mm的打孔器均匀打孔，以熔化的10 μL素琼脂封底并向孔内等量加入待测样品，4℃扩散5 h后，37℃培养12 h，观察是否出现抑菌圈。采用二倍稀释法［14］测定Lacticin LLC518的效价，以观察到抑菌圈出现的最高稀释度定义为1个活力单位(1 AU)，其倒数即为细菌素的效价(AU/mL)。

1.2.2 蛋白质浓度的测定

Lowry 法［15］。

1.2.3 硫酸铵沉淀法分离制备乳酸乳球菌素Lacticin LLC518粗提液(CPA)

接种乳酸乳球菌LLC518到MRS液体培养基中，37℃静止培养12 h作为种子液(OD600=1.5)，按4%的接种量接入250 mL MRS液体培养基中，37℃静止培养24 h。4℃、8 000 r/min离心20 min。将上清液以 40% 饱和度硫酸铵进行沉淀［16］，12 h 后，4℃，10 000 r/min离心45 min。将沉淀溶解于水，以截留分子质量为2 000 u的透析袋对水透析12 h，收集透析液，测定其效价并冷冻干燥制成干粉。

1.2.4 空载细胞的制备［6］

按4%的接种量将乳酸乳球菌LLC518接种于500 mL MRS液体培养基中，37℃静止培养24 h，4℃、8 000 r/min离心20 min，收集菌体。以5 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0)洗涤细胞3次，离心后将细胞悬于1.0 mol/L NaCl溶液中。用体积比为5%的磷酸调pH值至2.0，放置30 min后重悬于无菌水中，100℃，加热15 min，使残留在菌体表面的细菌素失活，4℃振荡1 h，以确保细胞表面已没有吸附的细菌素。8 000 r/min离心20 min收集菌体细胞并重悬于100 mL无菌水中备用，检测其抑菌活性。

1.2.5 空载细胞对细菌素吸附能力的测定［7］

称取一定量的Lacticin LLC518干粉溶于2 mL水中，将0.1 mL的Lacticin LLC518溶液加入1.8 mL不同pH值的5 mmol/L磷酸钠溶液中，分别加入0.1 mL细胞悬液。以0.1 mL蒸馏水代替Lacticin LLC518为对照X，以0.1 mL蒸馏水代替细胞悬液为对照Y。将上述混合物在4℃作用1 h后，15 000 r/min，离心5 min，分别取上清液测定其效价，并计算吸附率。

1.2.6 pH吸附法分离制备乳酸乳球菌素Lacticin LLC518粗提液(CPP)

按4%的接种量将乳酸乳球菌种子液接种于MRS液体培养基中，37℃培养13 h。发酵液置于70℃水浴25 min，调至最适吸附 pH 6.0，4℃放置2 h，9 000 r/min离心25 min，收集菌体细胞悬于0.1 mol/L，pH 2.0 的 NaCl溶液中，4℃，2 h 后，9000 r/min离心25 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，取滤液。将解吸附后的细胞与吸附后的上清液均匀混合，重复上述吸附和解吸附过程。合并滤液即为乳酸菌素Lacticin LLC518的粗提液。

1.2.7 pH吸附法与硫酸铵沉淀法分离效果的检测

40%硫酸铵沉淀得到的蛋白粗提液(CPA)及pH吸附后的蛋白粗提液(CPP)经透析处理，0.22 μm滤膜过滤后进行凝胶层析和RP-HPLC分析。具体条件如下:

分子筛凝胶层析柱填料为Sephadex G－50，柱型号为26×100 cm，上样量为5 mL，流速为1.5 mL/min。流动相为二级水。分别收集各峰洗脱液，冻干后进行抑菌活性的测定。

RP－HPLC层析采用C18半制备柱Waters Symmetry ShieldTM(5 μm ，19 mm ×150 mm)，上样量 970 μL，流速为 2.5 mL/min，柱温 25℃，检测波长 215 nm，洗脱液A相为超纯水，B相为色谱纯乙腈。洗脱程序:0～6 min:0～5%B，6～66 min:5% ～100%B，66～80 min:100%B;收集各峰洗脱液，冻干后进行抑菌活性的测定。

2 结果与讨论

2.1 pH吸附体系的建立

为了建立本实验所用菌株及细菌素的pH吸附体系，以40%饱和度硫酸铵沉淀制备的粗细菌素产品为吸附材料，检测空载细胞在不同pH条件下对Lacticin LLC518的吸附率(图1)。

图1 不同pH对Lacticin LLC518吸附率的影响

从图1可知，Lacticin LLC518在pH 2.0时，吸附率为0，随后吸附率逐渐上升，在 pH 6.0时达到100%，即细菌素完全吸附于产生菌上，pH 7.0后吸附率逐渐下降，在 pH 10.0时，吸附率下降到27.32%，从而确定pH 6.0为吸附pH值，pH 2.0为解吸附pH值，这一结果与康牧旭等［17］研究的乳酸片球菌素PA003对产生菌的吸附条件近似。

2.2 硫酸铵沉淀样品及pH吸附样品的分析

2.2.1 凝胶层析(Sephadex G-50)

将硫酸铵沉淀样品(CPA)及pH吸附样品(CPP)分别进行凝胶层析分析(图2、图3)，收集各峰并测定活性。

图2 硫酸铵沉淀样品的Sephadex G－50凝胶层析图谱

图3 pH吸附样品的Sephadex G－50凝胶层析图谱

经凝胶层析后，硫酸铵沉淀样品有2个峰(图2)，经抑菌实验证实第1个峰为活性峰，第2个峰为杂蛋白峰。而在同一条件下，pH吸附样品只有1个峰且抑菌活性高于硫酸铵沉淀样品的活性，可见通过pH吸附可去除部分杂蛋白。

2.2.2 RP-HPLC

将硫酸铵沉淀样品(CPA)及pH吸附样品(CPP)分别进行Sephadex G-50凝胶层析后，活性峰再经RP-HPLC层析分析，结果如图4及图5。

由图谱可知，pH吸附后的样品出峰数少于硫酸铵沉淀样品，且达到了基线分离，组份间分辨率较高。结果表明在pH吸附法中，菌体细胞可以较为专一地吸附发酵液中的细菌素分子，而对其他的杂蛋白吸附率不高，因而该方法可选择性的吸附细菌素，从而提高样品纯度。

图4 硫酸铵沉淀样品的RP－HPLC图谱

图5 pH吸附样品的RP－HPLC图谱

2.3 不同分离方法的比活及回收率的比较

以空载细胞作为吸附细胞时，Lacticin LLC518在pH 6.0时的吸附率达到了100%。为了明确pH吸附法从发酵液中分离Lacticin LLC518的效果，以pH 6.0吸附、pH 2.0解吸附为试验条件从发酵液中分离制备Lacticin LLC518粗制品，其比活由发酵原液的10.67 AU/mg提高到885.81 AU/mg，纯化倍数提高83.02倍。硫酸铵沉淀法制备的粗制品比活提高到334.64 AU/mg，纯化倍数提高31.36倍(表1，表2)。

表1 硫酸铵沉淀纯化Lacticin LLC518的纯化表

表2 pH吸附法纯化Lacticin LLC518的纯化表

由表1及表2可知，经pH吸附法分离纯化后， 样品纯化倍数高于经硫酸铵沉淀法制备的样品。2种粗制品经G－50凝胶层析后，纯化倍数分别为139.09和38.57，且前者比活为1484.06，比之 CPA提高了3.6倍，说明pH吸附法分离效果较硫酸铵沉淀法好。但回收率仅为20%，低于硫酸铵沉淀法的36.09%。为了提高回收率，采用多次吸附的方法对发酵液中的细菌素进行了吸附研究(图6)。

图6 多次吸附对Lacticin LLC518吸附效率的影响■－上清液中蛋白质浓度;●－解吸液蛋白质浓度国;▲－上清液抑菌圈直径;▼－回收率

由图6可知，多次吸附后上清液蛋白质浓度呈下降趋势，减少的蛋白质量与解吸液中的蛋白质浓度基本保持一致，说明蛋白质被细胞吸附后能够有效的释放到解吸液中，因而利用空载细胞建立的吸附解吸附系统可以有效的应用于发酵液中细菌素的分离。

在第1次和第2次吸附后，上清液的蛋白质浓度下降较大，分别从49.25 mg/mL下降到43.14 mg/mL和从43.14 mg/mL下降到36.30 mg/mL。但上清液的抑菌作用在第1次吸附前后变化较小，说明较多抑菌物质未被吸附，仍残留在上清液中，而经2次吸附后，上清液的抑菌作用显著降低，说明大部分的细菌素被吸附。造成这一现象的主要原因可能在于第1次吸附时细胞的吸附位点上可能已经有部分细菌素占据，或由于发酵液中存在着大量的细菌素而吸附位点数量有限而趋于饱和。在第1次解吸附处理后，大量吸附位点得到释放，进而在第2次吸附时可以进一步吸附大量的细菌素，最终使第2次吸附后，残留在上清液中的细菌素大量减少，因而抑菌活性显著减低。

但随着吸附次数的增加，特别经第5次吸附后，上清液中残留的蛋白质含量维持稳定，抑菌作用变化较小，说明后续增加吸附次数并不能增加细菌素的吸附以及杂蛋白的吸附，因而利用pH吸附法吸附细菌素专一性较强。同时，每次吸附的回收率随着吸附次数的增加而降低，由第1次的20%下降到第5次的0.63%，但总回收率达到53.13%，高于硫酸铵沉淀法的36.09%。

3 结论

乳酸乳球菌LLC518产生的乳酸乳球菌素Lacticin LLC518具有安全、抑菌活性强、抑菌谱广的特性，有作为天然食品防腐剂的潜力。为了进一步开发利用该细菌素，本文以Yang等［7］建立的pH吸附法为参照，研究了Lacticin LLC518的吸附规律，结果表明Lacticin LLC518对其产生菌细胞的吸附具有pH依赖性，在pH 6.0时完全被吸附到细胞上，在pH 2.0时完全解吸附。借助此pH吸附模型利用发酵液中的细菌素产生菌对所产Lacticin LLC518进行了分离纯化。以硫酸铵沉淀样品为对照，发现pH吸附法的分离效果优于常用的硫酸铵沉淀法，其纯化倍数为83.02高于硫酸铵沉淀法的31.36，并通过多次吸附处理提高了回收率，总回收率高达53.13%，凝胶层析和RP-HPLC的分析亦表明pH吸附法样品较硫酸铵沉淀样品杂峰少，说明pH吸附法具有良好的分离效果。本研究的结果为建立Lacticin LLC518的最佳纯化方法，进而对该细菌素性质的研究以及扩大化生产奠定了基础。

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The Studies on Purification of Lacticin LLC518 by pH-Adsorption Method

Fang Jia-qi，Zhu De-qiang，Ke Fang-fang，Chen Xiao-lin，Zhang Ming
(College of Life Sciences，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China)

The adsorption rates of Lacticin LLC518 on Lactococcus lactis subsp.lactis 518 at different pH conditions were studied.The results showed that the adsorption rate was 100%at pH 6.0 while no Lacticin LLC518 was adsorbed at pH 2.0.Therefore，the crude Lacticin LLC518 was prepared from the cell-free supernatant of the L.lactis subsp.lactis 518 culture when the exterior environment had a pH of 6.0 and 2.0 by absorbing and desorbing Lacticin LLC518，respectively.The pH absorption method has an obvious advantage superior to the ammonium sulphate precipitation method for its better absorption effect when the crude Lacticin LLC518 from precipitation with ammonium sulfate as a control.The specific activity of Lacticin LLC518 was increased 83.02 fold with a yield of 20% .

Lacticin，pH －adsorption，isolation，chromatography technology，efficiency

硕士研究生(张明为通讯作者)。

*国家863计划项目(2008AA10Z319);安徽省高等学校省级质量工程项目(20101899)

2011－05－08，改回日期:2011－08－26