守宫硫酸多糖对肝癌SMMC-7721细胞分化和增殖的影响

辛 亮 吴雄志 谢广茹

据我国卫生部统计资料，2004—2005年我国肝癌年死亡率约为26.06/10万，居癌症中的第2位[1]。我国原发性肝癌90%以上为肝细胞肝癌（HCC）。目前临床常用的治疗方法为手术、化疗及微创治疗等，但有许多患者因体质虚弱和病期较晚，无法接受上述治疗，因此寻求有效而又低毒性的药物用于治疗肝癌有重要的临床意义。守宫又称壁虎、天龙等，为壁虎科动物多疣壁虎（Gekko swinhonis Guenther）的干燥全体。笔者已成功地分离提取出了守宫中的抗癌化合物守宫硫酸多糖（Gepsin）[2]，来源于守宫的水煮醇沉物。本研究旨在观察由守宫中提取的Gepsin对肝癌细胞系SMMC-7721细胞增殖和分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌细胞系SMMC-7721（天津医科大学附属肿瘤医院免疫室）；人转化生长因子（TGF）-β1酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（晶美生物工程有限公司Human FHK 0029 TGF-β1）；人血管内皮生长因子（VEGF）ELISA 试剂盒（晶美生物工程有限公司）；苏拉明（Suramin，Sigma）；常温离心机（Heraeus）；低温高速离心机（Heraeus sepatech）；酶标仪（Labsystem Multiscann MS）；照相设备（BioRAD和Polaroid）。

1.2 方法

1.2.1 SMMC-7721细胞增殖与活细胞率测定 SMMC-7721细胞以1×104/mL密度接种于24孔板中，接种后24 h加药培养，分设Gepsin高剂量组（Gepsin 100 mg/L）、Gepsin低剂量组（Gepsin 10 mg/L）与阴性对照组（加等体积1640+10%FBS培养液）共3组，每组5孔。加药后30 min，24、48、72、96、120、144 h分别收集细胞，利用台盼兰染色，光学正置显微镜下计数死细胞与活细胞，做生长曲线，并计算活细胞率，活细胞率（%）=未着色细胞数/细胞总数×100%。

1.2.2 细胞培养上清中甲胎蛋白（AFP）与白蛋白（ALB）检测 将已进入对数生长期的生长旺盛的SMMC-7721细胞消化后，离心，显微镜下计数，以1×104/mL密度接种于24孔板中，共分3组，即Gepsin高剂量组、Gepsin低剂量组与对照组；每组5孔，接种后24 h加药，加药培养7 d后收集上清。以联合放免法测定AFP，溴钾酚绿法测定ALB。

1.2.3 光学显微镜下观察细胞形态改变 于24孔板中接种SMMC-7721细胞，共分3组，即Gepsin高剂量组、Gepsin低剂量组与对照组（剂量同前），光学显微镜下观察细胞形态改变。

1.2.4 ELISA法检测上清液中TGF-β1、VEGF的水平 镜下观察培养瓶内的SMMC-7721细胞生长旺盛，进入对数生长期后，将细胞消化、稀释、计数，并以5×104/mL的浓度将细胞接种入6孔板中，共分5组，即Gepsin高剂量组、Gepsin低剂量组、对照组，Suramin低剂量组（0.25 mg/L）和Suramin高剂量组（2.5 mg/L），每组5孔，加药培养4 d后收集上清，上清液中TGF-β1、VEGF的水平以ELISA法检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0软件统计分析，计量资料采用±s表示，各组均数间的比较采用方差分析，进一步比较采用LSD检验；重复测量计量资料采用重复测量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gepsin影响SMMC-7721细胞增殖的生长曲线 不同时间之间细胞增殖的差异有统计学意义，不同分组间差异有统计学意义，时间与分组之间存在交互效应（均P<0.001），见表1。72 h时，低剂量组、高剂量组与对照组相比差异均有统计学意义；120、144 h时3组间两两比较差异均有统计学意义，见表2。生长曲线显示Gepsin对SMMC-7721细胞增殖有抑制作用，Gepsin高剂量组和Gepsin低剂量组的SMMC-7721细胞增殖明显受到了抑制。

表1 Gepsin影响SMMC-7721增殖的细胞数变化（n=5，104/mL，±s）

表1 Gepsin影响SMMC-7721增殖的细胞数变化（n=5，104/mL，±s）

F时间=491.30，F交互=86.74，F分组=243.55，均 P<0.001

组别对照组低剂量组高剂量组30 min 1.58±0.14 1.33±0.14 1.50±0.25 24 h 1.75±0.25 1.75±0.43 1.58±0.29 48 h 2.58±0.14 2.00±0.43 2.50±1.30 72 h 3.50±0.25 2.25±0.25 2.08±0.38组别对照组低剂量组高剂量组96 h 4.33±0.63 3.75±0.43 3.67±0.38 120 h 8.17±0.88 6.58±0.38 5.00±0.25 144 h 25.25±1.25 10.75±0.90 7.75±1.15

表2 不同时间细胞计数重复测量方差分析组间比较P值

2.2 Gepsin影响SMMC-7721细胞活率的曲线 对照组、Gepsin高剂量组和Gepsin低剂量组的细胞活率采用重复测量的方差分析进行比较，F时间=1.418，F交互=1.035，F分组=1.327，差异无统计学意义（均 P>0.05），且细胞活率较高，均在90%以上，见图1。

2.3 Gepsin对SMMC-7721细胞分泌上清中ALB和AFP的影响 Gepsin低剂量组、Gepsin高剂量组ALB均高于对照组，差异有统计学意义。Gepsin低剂量组、Gepsin高剂量组AFP低于对照组，高剂量组的分泌量低于低剂量组，差异均有统计学意义，见表3。

表3 Gepsin对SMMC-7721细胞分泌上清中ALB和AFP的影响 （±s）

表3 Gepsin对SMMC-7721细胞分泌上清中ALB和AFP的影响 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

组别对照组（1）低剂量组（2）高剂量组（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）n5 5 5 ALB（mg/107）33.94±6.37 49.59±4.11 62.59±14.29 11.37*0.017<0.001 0.070 AFP（ng/106）663.08±82.83 496.87±90.69 369.06±63.06 17.10**0.006<0.001 0.026

2.4 光学显微镜下观察细胞形态改变 对照组SMMC-7721光镜下正常形态为圆形，加入Gepsin后细胞的形态发生明显变化，变为纺锤形。对照组的SMMC-7721细胞增殖活跃，排列紧密；加药后细胞分散排列，变化明显。

2.5 ELISA法检测培养上清中细胞因子TGF-β1、VEGF的分泌量变化 （1）TGF-β1：对照组低于Gepsin高剂量组，差异有统计学意义（P<0.01），Gepsin低剂量组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。Suramin高剂量组低于Gepsin低剂量组和Gepsin高剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。（2）VEGF：对照组与Gepsin高剂量组和Gepsin低剂量组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Suramin低剂量组高于Gepsin低剂量组和Gepsin高剂量组，差异有统计学意义（P<0.01）。Suramin高剂量组与Gepsin低剂量组和Gepsin高剂量组相比较，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表4。

3 讨论

守宫硫酸多糖是由中药守宫中分离出的抗癌化合物。硫酸多糖（sulfate polysaccharide）是指糖羟基上带有硫酸根的多糖，是抗病毒多糖中研究最多的一类[3]，天然硫酸多糖最先发现于软骨素以及从猪肠黏膜中提取的肝素，后来发现还广泛存在于海藻类植物。随着研究的深入，人们发现硫酸多糖具有显著的抗凝血、抗肿瘤、抗病毒等活性，还是一种双歧因子[4]，能有效增强机体免疫能力。海带硫酸多糖（laminaria polysaccharide sulfate，LPS）是一种含有多种单糖和硫酸基的水溶性杂多糖，其生物学功能主要集中在抗肿瘤、免疫调节、血脂及血糖调节等方面。硫酸多糖可通过与生长因子和黏附因子结合来抑制类肝素酶，分离出硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的乙酰肝素链，通过乙酰肝素链引起生长因子的释放[5]。一些硫酸多糖可以引起瘤细胞的分化和凋亡，但是机制不明。另外，硫酸多糖可增强机体对瘤细胞的先天性和适应性的免疫应答[6]。研究证实来自角叉菜的不同分子质量的λ-角叉藻聚糖在体内有抗肿瘤和免疫调节活性[7]。

表4 ELISA法检测培养上清中细胞因子的分泌量变化比较 （n=5，mg/L，±s）

表4 ELISA法检测培养上清中细胞因子的分泌量变化比较 （n=5，mg/L，±s）

*P<0.05，**P<0.01

组别Suramin低剂量组（1）Suramin高剂量组（2）对照组（3）Gepsin低剂量组（4）Gepsin高剂量组（5）F P（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）TGF-β1 195.00±12.39 114.73±41.92 125.89±36.25 194.14±51.97 245.26±56.84 4.81*0.981 0.181 0.046 0.004 0.079 0.007 VEGF 425.92±9.12 481.05±3.95 238.72±1.32 216.32±13.52 308.78±13.54 431.21**0.001 0.005 0.004 0.010 0.658 0.110

本研究显示，Gepsin可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721细胞的增殖，但对细胞活率影响不大，原因可能是Gepsin通过影响细胞的分化和增殖来发挥抗癌剂的作用。对于形态的影响方面，SMMC-7721细胞正常特征在光镜下为圆形，但加Gepsin后细胞变为纺锤形。Chedid等[8]曾报道肝癌细胞表现为多角形和纺锤形2种形状，并且纺锤形细胞预后较好。Gepsin对肝癌细胞的2种特异性蛋白ALB和AFP都产生了明显影响，即可使肝癌细胞的某些指标向成熟肝细胞发生转化。Gepsin高剂量组的TGF-β1明显升高，提示Gepsin可能通过上调TGF-β1的表达来诱导肝癌细胞系SMMC-7721的分化。Gepsin作为一种中药抗癌剂可使SMMC-7721细胞的增殖抑制、细胞形态向更好的方面发生改变，以及其加药组培养上清中的AFP及ALB的明显差异，均可说明Gepsin的确可抑制SMMC-7721细胞的增殖并诱导其发生分化。TGF-β1本身是抑制肿瘤细胞增殖的，本药处理组使肝癌SMMC-7721细胞分泌的TGF-β1水平明显增高，从一方面说明了Gepsin可通过升高TGF-β1水平来诱导肝癌细胞的分化的同时，TGF-β1本身具有的抑癌作用是否通过某种机制得到了恢复，这还有待于进一步的研究加以证实。由实验结果可以看出，Gepsin对SMMC-7721细胞诱导分化作用与VEGF的表达水平无关，分析原因可能是该药不是通过抑制肿瘤细胞的血管生成而使其分化，从而实现其抗癌作用。

总之，经多次实验证实，作为肝癌的分化诱导剂，Gepsin是有效的。Gepsin可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖，诱导SMMC-7721细胞分化。其机制可能是通过上调TGF-β1来诱导肝癌细胞分化实现的。守宫作为中药抗癌药早在几百年前即开始应用，守宫硫酸多糖是从守宫中分离出的抗癌化合物，其诱导分化的影响机制还有待于进一步的研究。

[1]中华人民共和国卫生部.2009年中国卫生统计提要.2009[EB/OL].[2009-05-20]http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohbgt/s8274/200905/40765.htm

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