不同取代度N-邻苯二甲酰壳聚糖抗氧化活性的研究

孙 涛，银旭红，谢 晶，康永锋，周冬香

上海海洋大学食品学院，上海201306

不同取代度N-邻苯二甲酰壳聚糖抗氧化活性的研究

孙 涛，银旭红，谢 晶，康永锋，周冬香

上海海洋大学食品学院，上海201306

低聚壳聚糖与邻苯二甲酸酐酰化得到三种取代度不同的N-邻苯二甲酸酐酰低聚壳聚糖NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC，取代度分别为0.33、0.55和0.65。通过红外光谱对其结构进行表征。并考察了其抗氧化性能。结果表明:COS的抗氧化性能最强;随着取代度的增加，N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖对超氧阴离子的清除能力逐渐升高;而对DPPH的清除能力以及还原能力呈逐渐下降趋势;对羟基自由基的清除顺序大小依次为NPCOSB＞NPCOSA＞NPCOSC，即NPCOSB清除羟基自由基的的能力最佳。

低聚壳聚糖;N邻苯二甲酰化低聚壳聚糖;抗氧化性

低聚壳聚糖是壳聚糖的降解产物，其结构单元中有大量的-OH和-NH2，具良好的抗氧化活性［1，2］，同时也决定低聚壳聚糖可进行多功能基团的化学反应。低聚壳聚糖改性反应可以在-NH2上进行，也可以在-OH位上进行，且取代位置、取代基团以及取代程度都会直接影响到低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性能。研究发现，N-羧甲基低聚壳聚糖随着羧甲基在NH2上的取代程度的增加，其对DPPH的清除能力和还原能力下降，对超氧阴离子的清除能力先升高后下降［3］。N-季铵盐壳聚糖衍生对羟基的清除能力随着取代度的升高而增强［4］。N-邻苯二甲酰化低聚壳聚糖是低聚壳聚糖N位酰化后的低聚壳聚糖衍生物，因其具有良好的生物相容性，吸湿、保湿性质以及它可以作为高分子药物和人造组织等异性生物材料的关键中间体而受关注［5，6］。但是其抗氧化，尤其是其抗氧化性与取代度之间的关系还尚见报道。

前期对不同取代度的羧甲基低聚壳聚糖和季铵盐低聚壳聚糖抗氧化性研究显示［7-9］，不同壳聚糖衍生物的抗氧化活性呈现出的规律各异，这可能与取代度和取代基团的性质有关。作为一种重要的低聚壳聚糖衍生物，研究N-邻苯二甲酰化低聚壳聚糖的抗氧化性能，即能完善低聚壳聚糖衍生物的抗氧化机理，同时也希望开发一种更为有效的低聚壳聚糖衍生物抗氧化剂。本实验以低聚壳聚糖为原料，制备了三种不同取代度的N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖，并研究了其抗氧化能力与取代度程度之间的关系。初步探讨了N-邻苯二甲酰基的取代度对其抗氧化活性的影响规律。

1 实验部分

1.1 材料

低聚壳聚糖，购自浙江金壳生物化学有限公司(凝胶色谱测定其分子量为5000 Da);鲁米诺，DPPH，购自Sigma公司;其余试剂均为分析纯，购自上海化学试剂公司。

1.2 低聚壳聚糖衍生物的制备及表征

称取5.0 g低聚壳聚糖至于反应器，加入100 mL蒸馏水，搅拌溶解，称取1.0 g邻苯二甲酸酐，用20 mL丙酮溶解，然后缓慢加入反应器，在室温下搅拌反应15 h，然后用丙酮沉淀，过滤，产物用丙酮反复洗涤，最后在60℃烘干，得到NPCOSA［10］。保持其他条件不变，分别称取2.0 g和5.0 g邻苯二甲酸酐，得到NPCOSB和NPCOSC。

红外光谱在EQUNOX55傅立叶红外-拉曼光谱仪上进行，采用KBr压片法制样，测定波数范围为500～4000 cm–1，分辨率为0.8 cm–1。

1.3 取代度的测定

准确称量N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖0.1000 g置500 mL烧杯内，准确加入0.1038 mol/L HCl标准溶液20.00 mL溶解样品，再加入去离子水200 mL稀释、混匀，用0.4685 mol/L NaOH标准溶液返滴，测定电导率值。做电导率-氢氧化钠体积关系图，添加趋势线，求其回归方程，从而计算N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖的取代度［11］。

1.4 对超氧阴离子自由基O-·2的清除

用pH=10.20的0.05 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液配制浓度为1.5×10–3mol/L的鲁米诺溶液，用1×10–3mol/L的盐酸配制浓度为0.1 mol/L的邻苯三酚储备液，使用前用去离子水稀释至1× 10–4mol/L。以缓冲液作为溶剂，配制成不同浓度的样品溶液。用流动注射化学发光分析仪依次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积。清除率=(A0－Ai)/A0×100%。式中A0为空白溶液峰面积;Ai为样品溶液峰面积。经SOD，过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基为超氧阴离子O［12］。

黑龙江省八五○农场坐落于完达山南麓，穆棱河北畔；始建于1954年，总土地面积527 km2，平原区面积363 km2；1997年开始种植水稻，当年种植面积0.87×104hm2，至2017年，井灌水田面积已达到2.43×104hm2，占平原区面积的67%，是地下水开采强度最大的农场。其平原区是第四纪冲积洪积区，地表覆盖0～4 m的亚砂、亚黏土，下有20～80 m的砂、砾石含水层，是三江平原典型的潜水区。

1.5 对羟基自由基·OH的清除

用pH=7.40的0.05 mol/L KH2PO4-NaOH缓冲溶液分别配制浓度为6.4×10–4mol/L的鲁米诺溶液、0.012 mol/L H2O2和0.8 mg/mL亚铁氰化钾溶液。以缓冲液作为溶剂，配制成系列不同浓度的样品溶液。依上述方法测定并计算样品清除羟基自由基的活性。经SOD，过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基羟基自由基·OH［12］。

1.6 对DPPH自由基的清除

在装有2.0 mL的浓度为1×10–4mol/L DPPH无水乙醇溶液的比色管中，加入不同浓度的样品溶液2.0 mL，摇匀，33℃避光静置半小时，在517 nm处测量吸光度Ai。用去离子水代替样品溶液，得吸光度A0，无水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。清除率=［1－(Ai－Aj)/A0］×100%［13］。

1.7 还原能力的测定

还原能力根据文献［14］测定并稍做改进。取2.0 mL不同浓度的样品，加入pH=6.6的0.2 mol/ L磷酸缓冲液1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混匀，50℃水浴20 min后迅速冷却，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀后在2000 r/min下离心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，静置十分钟后在700 nm处测定吸光度。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱

图1 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的红外光谱Fig.1 FTIR spectra of COS，NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC

图1是COS以及其N-邻苯二甲酰衍生物的红外图。3416 cm–1处峰是壳聚糖分子中的醇的VO-H，羧基的VO-H以及酰胺中的VN-H振动峰的合并谱带。1264 cm–1处是 OH的的弯曲振动吸收峰，1073 cm–1和1023 cm–1处分别是C3仲羟基和C6伯羟基的C-O的伸缩振动吸收峰。1157 cm–1处及894 cm–1处的吸收峰是壳聚糖的β-(1，4)糖苷键的特征吸收峰。

与COS相比的红外图谱相比［15］，N-邻苯二甲酰化低聚壳聚糖衍生物在3400 cm–1附近的峰此变窄，并发生红移，这说明COS中的氨基参加了反应，-NH2减少。1650、1555、1380、1329 cm–1附近的吸收峰强度增大，其中1650 cm–1酰胺Ⅰ的吸收峰，1555 cm–1是酰胺Ⅱ的吸收峰，1380 cm–1是酰胺Ⅲ的吸收峰，1329 cm–1处是C-CH3的变形振动吸收带，这证明了邻苯二甲酸酐与壳聚糖的酰化反应是发生在-NH2上。随着取代度的增加，在1710 cm–1处，邻苯二甲酸酐峰越来越明显;在750 cm–1附近的吸收峰为邻二取代苯的δAr-H面外弯曲振动峰，而在壳聚糖中未见此峰，这些证实了衍生物中羧基苯甲酰基的存在［16］。进一步证实了壳聚糖发生了邻苯二甲酰化反应。电导法测得NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的取代度分别是0.33、0.55和0.65。

2.2 对超氧阴离子自由基O-·2的清除

图2 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC对超氧阴离子的清除Fig.2 Scavenging effects of COS，NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC on superoxide anion

图2是COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC对超氧阴离子的清除曲线图。从图上可以看出，随着浓度的升高，它们对超氧阴离子的清除能力增强。COS清除超氧阴离子能力最强。三种衍生物对超氧阴离子清除能力没有明显的差异，大小顺序依次为NPCOSC＞NPCOSB＞NPCOSA。

低聚壳聚糖及其衍生物清除自由基的能力可能与羟基和氨基的数目以及羟基和氨基的活性有关。与邻苯二甲酰低聚壳聚糖衍生物相比，低聚壳聚糖含有的氨基和羟基的数目最多，故对超氧的清除能力最强。而邻苯二甲酰壳聚糖衍生物，随着取代度的增大，对超氧的清除能力逐渐增强。这可能是由于吸电子基团-COC6H4COO–的引入，降低了COS主链上的电子云密度，从而降低了羟基和氨基生成氢键的几率，使得氨基和羟基的活性增强，易于与超氧反应。所以，随着取代度的增加，尽管氨基的数目的减少，但对超氧的清除能力增强。

2.3 对羟基自由基·OH的清除

图3 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC对羟基自由基的清除Fig.3 Scavenging effects of COS，NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC on hydroxyl radical

图3是COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC对羟基自由基的清除曲线图。由图可知，所有样品对羟基自由基的清除能力都是随着浓度的升高而增强。COS、NPCOSA、NPCOSB对羟基自由基的半抑制浓度分别为0.26、0.30、0.42 mg/mL，而NPCOSC对羟基自由基的清除能力未达到50%。COS清除羟基的能力最强，邻苯二甲酰衍生物对羟基自由基的清除能力大小依次为 NPCOSB＞NPCOSA＞NPCOSC，这不同于它们对超氧的清除能力。这是由于与超氧阴离子不同，羟基自由基是一种很活泼的自由基，因此对引进基团-COC6H4COO–所产生的空间位阻很敏感。因此邻苯二甲酰衍生物对羟基的清除能力是氨基数目，-COC6H4COO–的电子效应及空间位阻三者综合作用的结果。

2.4 对DPPH的清除活性

图4 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC对DPPH自由基的清除Fig.4 Scavenging effects of COS，NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC on DPPH radicals

图4为低聚壳聚糖及其N-邻苯二甲酰衍生物对DPPH自由基的清除曲线图。由图可知，随着浓度的升高，COS，NPCOSA和NPCOSB对DPPH的清除能力增强，而NPCOSC在浓度达到1.30 mg/mL后，随着浓度的继续升高，对DPPH的清除能力下降。COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC对DPPH的半抑制浓度分别为:0.36、0.53、0.74 mg/mL和0.89 mg/mL。随着取代度的升高，NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC清除DPPH的能力逐渐下降。

DPPH是一种相当稳定的自由基，可接受氢或电子形成稳定的分子。壳聚糖分子链中的活性氨基和羟基可以提供氢与DPPH结合，从而达到清除DPPH的目的。随着取代度的升高，活性氨基越少，供氢能力越弱，故 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC对DPPH的清除能力依次减弱。此解释同样适合于COS及其N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖衍生物的还原能力。

2.5 还原能力

图5 COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的还原能力Fig.5 Reducing power of COS、NPCOSA、NPCOSB and NPCOSC

图5是COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的还原能力的曲线图。从图可以看出，当样品浓度为2.50 mg/mL时，COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的吸光值依次为0.85、0.64、0.44和0.40。COS、NPCOSA、NPCOSB和NPCOSC的还原能力依次减弱。这表现与对DPPH的清除能力一样的规律。COS上的氨基被邻苯二甲酸酐取代后，活性氨基数目减少，且随着取代度的升高，活性氨基的数目减少，供电子能力下降，故还原能力下降。

3 结论

本文对低聚壳聚糖进行酰化改性，制备了取代度不同的三种N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖，并考察了它们对超氧阴离子，羟基自由基，DPPH的清除能力以及还原能力。结果表明:N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性与壳聚糖相比，有所降低。

N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性不但与羟基和氨基的数目有关，还与羟基和氨基的活性有关。N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖衍生物中引进-COC6H4COO–，会影响氨基和羟基的活性，从而影响到N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性能。本实验对壳聚糖及其衍生物抗氧化机理的深入研究和天然抗氧化剂的开发利用提供了相关依据和理论思路。

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Antioxidant Activity of N-Phthaloyl-Chitosan Oligosaccharide with Different Substituting Degrees

SUN Tao，YIN Xu-hong，XIE Jing，KANG Yong-feng，ZHOU Dong-xiang
College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306

N-phthaloyl chitosan oligosaccharides(NPCOSA，NPCOSB and NPCOSC)，having various degrees of substitution(DS were 0.33，0.55 and 0.65，respectively)were prepared by chemical modification of chitosan oligosaccharide.The chemical structures of the chitosan oligosaccharides derivatives were characterized by FTIR.Their antioxidant activities were evaluated by the scavenging of superoxide anion radicals(O)，hydroxyl radical(·OH)，DPPH radical and deter mination of reducing power.The results indicated that all the N-phthaloyl chitosan oligosaccharides showed lower antioxidant activity than chitosan oligosaccharides，the scavenging effect on Oincreased with the increasing of DS，and their scavenging effect on DPPH and reducing power both were decreased with the increasing of DS;the order of their scavenging effect on·OH was NPCOSB＞NPCOSA＞NPCOSC，and the NPCOSB showed the strongest scavenging effect on·OH.

chitosan oligosaccharide;N-phthaloyl chitosan oligosaccharide;antioxidant

1001-6880(2011)04-0713-05

2009-11-16 接受日期:2010-04-21

上海市教委重点学科建设项目(J50704)，上海市重点学科建设项目专项基金(T1102)，上海市生物医药和农业科技领域重点科技项目(08391911500)，2009年上海市优秀学科带头人计划(09XD1402000)

*通讯作者 Tel:86-21-61900363;E-mail:taosun@shou.edu.cn

TS202.3

A