β-环糊精包合雨生红球藻皂化产物可行性研究

万庆家，饶高雄，鸭 乔，张秋玲，龙 祥

1云南绿A生物工程有限公司，昆明650106;2云南中医学院，昆明650500

β-环糊精包合雨生红球藻皂化产物可行性研究

万庆家1*，饶高雄2，鸭 乔1，张秋玲1，龙 祥1

1云南绿A生物工程有限公司，昆明650106;2云南中医学院，昆明650500

本文以雨生红球藻皂化产物中虾青素含量为评价指标，对β-环糊精包合雨生红球藻皂化产物可行性进行了实验研究。试验结果表明，当雨生红球藻粉在优选的实验条件下皂化产物经β-环糊精包合后，HPLC检测主要成分组成未见明显变化，包合率可达到90%。于温度40℃，湿度75%条件下进行稳定性加速实验，结果表明，经皂化后包合物中虾青素稳定性较好，达到了药物和保健食品原料的稳定性要求，说明该方法可行。

雨生红球藻;虾青素;皂化;β-环糊精;包合率;稳定性

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞绿藻，属于绿藻门(Chlorophyta)，绿藻纲(Chlorophyceae)，团藻目(Volvocales)，红球藻科(Haematococcaceae)，红球藻属(Haematococcus)，是虾青素的天然来源中含量最高的，高达细胞干重的1.0%～3.0%。雨生红球藻粉生成的类胡萝卜素中70%为虾青素单酯，10%为虾青素二酯，5%的游离虾青素，以及15%的β-胡萝卜素，角黄素，叶黄素，及其他类胡萝卜素［1，2］。雨生红球藻中虾青素结构类型以全反式为主，含有少量的顺式结构。

虾青素(Astaxanthin，3，3-二羟基-8，3'-胡萝卜素4，4-二酮)属于酮式类胡萝卜素，它由8个异戊二烯单位构成，是一种多萜类不饱和化合物，其显著的效果包括改进关节健康、防护阳光伤害、预防老年性黄斑变性、预防某些癌症、增强免疫力等，在食品添加剂、化妆品、保健品和医药工业等方面具有广阔的应用前景［3，4］。

赵立艳等人测定了雨生红球藻提取物皂化前后的抑制油脂过氧化能力、清除DPPH·自由基能力和还原力，结果表明雨生红球藻提取物皂化前后在三种评价方法中都表现出了较强的抗氧化活性［5］。人体实验表明:血清中未检测出虾青素酯，表明虾青素酯在吸收后迅速水解，综上所述，虾青素在人体内以游离态形式存在并发挥作用。

由于虾青素中含有一个长的共轭双键系统，比其他异戊二烯化合物更不稳定，光、热、酸和氧作用均易破坏虾青素的结构，所有的研究资料和稳定性实验表明，无论是破壁后的雨生红球藻粉，还是其提取物，均需要低温避光真空保存，甚至需要冷冻避光真空保存，严重限制了它的广泛应用，因此，提高虾青素稳定性是一个急需解决的关键问题。

文中采用环糊精包合技术对虾青素进行包合，以提高虾青素稳定性及利用率，但由于雨生红球藻粉虾青素提取物中含有一定量的脂肪，对包合效果影响很大，使包合率大大降低，文中通过皂化降低提取液中脂肪含量，达到改变虾青素在水中的溶解度、起到了抗氧化、抗光和热的作用，增加了药物的稳定性能、并拓宽药物可开发的剂型和可利用范围(饮料和化妆品)，为进一步开发天然的虾青素产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

ER-82B型分析天平:日本A＆D公司;HHS型电热恒温水浴锅:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;CF7D2型离心机:江西华科精密仪器有限公司; Agilent 1100高效液相色谱仪;NF1001V/CCA-1110/ A-3S型旋转蒸发仪:日本EYELA公司;RW20型搅拌机:德国IKA公司;ALPHA1-4型冷冻真空干燥器:德国CHRIST公司;CQ-25-12型超声波清洗器:中科先达超声电子有限公司。

1.1.2 材料及溶液配制

雨生红球藻粉(破壁处理):由云南绿A生物工程有限公司提供;BHT(Butylated Hydroxytoluene;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、β-环糊精:上海伯奥生物科技有限公司，药用级;KOH、甲醇、乙醇、三氯甲烷等均为分析纯;丙酮:色谱纯。氮气:氮气含量≥98.5%;全反式虾青素对照品(99.8%):瑞士SIGMA公司购买。

三氯甲烷-BHT溶液(0.5 g/L):取0.5 g BHT溶于1 L三氯甲烷(分析纯)，摇匀即得。

甲醇制氢氧化钾溶液(0.1 mol/L):取5.6 g氢氧化钾用适量纯化水使溶解，用甲醇定容至1 L，即得。

1.2 雨生红球藻粉皂化方法［6，7］

取雨生红球藻粉(HPLC 2.5%)2.0 g，置于250 ml三角瓶中，加入三氯甲烷-BHT溶液80 ml避光充氮气，50℃水浴锅中放置10 min，过滤，滤渣按上述操作反复几次，至滤液基本无色;合并滤液至500 mL棕色容量瓶中。加入100 mL 0.2 mol/L氢氧化钾/甲醇溶液，用三氯甲烷-BHT溶液定容至刻度，摇匀后充氮保护，同时用自封胶带密封，置4℃环境中避光摆放12 h，取出倾倒于1.5 L分液漏斗中，加水500 mL轻摇分液漏斗数次混悬均匀，静置分层，下层液同法再萃取一次后，合并滤液至500 mL棕色容量瓶中定容即得。

1.3 UV法检测总虾青素含量及皂化过程中总虾青素保存率计算方法

精密称取0.03 g藻粉于离心试管中，加5 mL丙酮溶液振摇溶解，置50℃恒温水浴锅中振摇提取10 min。再在转速为3500 r/min下离心2 min，取上清液移至25 mL容量瓶中。再向离心试管中加入5 mL丙酮溶液重复上述操作直到样品变为灰白色时，合并提取液用丙酮定容至刻度，摇匀，取1 mL至10 ml容量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀即得。取供试品溶液于1 cm玻璃比色皿中，于474 nm波长处测定吸光度，计算总虾青素含量。皂化产物浓缩回收氯仿后，用丙酮溶解定容后按上述方法检测。

皂化反应中总虾青素保存率(%)=皂化产物中总虾青素含量×所得皂化产物重量/皂化前藻粉总虾青素质量×100%

1.4 β-环糊精包合物的制备

将1.2所得溶液于旋转蒸发仪中室温浓缩至干膏后，加入5 mL乙醇溶解。另称取β-环糊精10 g于烧杯中，加水50 ml，在50℃条件下搅拌使全部溶解后，将雨生红球藻的皂化产物乙醇溶液滴加至β-环糊精水溶液中，恒温搅拌7 h，搅拌转速在600 r/ min左右，试验过程中保持避光，溶液通氮气保护。然后冷却至室温，置冰箱内冷藏24 h，抽滤，并先后用适量蒸馏水快速洗涤，40℃真空干燥，研碎，即得雨生红球藻的皂化产物β-环糊精包合物。

1.5 HPLC检测全反式虾青素的含量

精密吸取10 mL 1.2项下所得溶液转移至25 mL棕色容量瓶中，加入三氯甲烷-BHT定容，摇匀后HPLC检测。以下步骤需要在避光条件下进行，试验环境温度不宜超过25℃，样品处理过程均需氮气保护。色谱条件色谱柱:YMC-Pack ODS-A 250× 4.6 mm L.D S-5 μm;流动相:其中以丙酮为流动相A、以水为流动相B，梯度洗脱。流速:0.8 mL/min;波长:476 nm;柱温:20℃。进样量:20 μL。

1.6 包合物中全反式虾青素含量的测定及包合率计算

精密称取包合物0.2 g置于锥形瓶中，加5 mL水溶解后，加入三氯甲烷-BHT 5 mL，摇匀，置超声波清洗器中处理10 min，使虾青素转移至有机相中，如此反复数次，直至水相变为无色为止。将有机相合并、无水Na2SO4脱水后，HPLC检测。按下列公式计算包合率。

包合率(%)=微囊中虾青素含量×所得微胶囊重量/包合前虾青素质量×100%

1.7 包合物中全反式虾青素的稳定性试验

取适量包合物样品于称量瓶中，于温度40℃，湿度75%条件下置于加速稳定性试验箱内进行稳定性加速试验，分别于第0、1、2、3月测定虾青素含量，与原始含量相比得全反式虾青素残存率。同时用雨生红球藻粉样品做对照试验，用HPLC法检测虾青素含量。

2 结果与讨论

2.1 实验结果

2.1.1 皂化反应前后成分对比分析

全反式虾青素标准品HPLC图谱(保留时间为6.758 t)见图1:

图1 全反式虾青素标准品HPLC图谱Fig.1 The HPLC chromatogram of tran-astaxanthin standard

皂化反应试验结果表明，当雨生红球藻粉在实验条件下，皂化基本完全后产物主要为全反式虾青素(保留时间为6.758 t)，同时含有少量未皂化虾青素酯以及少量其他构型的游离虾青素，如图2所示:

图2 雨生红球藻皂化产物HPLC图谱Fig.2 The HPLC chromatogram of saponification of H.pluvialis

而雨生红球藻粉的虾青素皂化前绝大部分以酯的形式存在，HPLC色谱图如图3所示:

2.1.2 包合前后成分对比分析

试验结果表明，雨生红球藻粉皂化产物在适当的包合条件下得到的包合物，其HPLC图谱构成与比例与包合前基本一致，未见明显改变，主要成分仍是全反式虾青素。

图3 雨生红球藻粉HPLC图谱Fig.3 The HPLC chromatogram of powder of H.pluvialis

2.1.3 皂化过程中总虾青素保存率试验结果

按1.2项下方法进行皂化试验，按1.3项下方法进行检测计算，结果如下表1所示，3个批次雨生红球藻粉皂化前后总虾青素平均保存率为92.3%。

表1 皂化过程中总虾青素保存率试验结果Table 1 The results of survival rate of astaxanthin within saponification

表2 包合过程中全反式虾青素包合率试验结果Table 2 The results of inclusion rate of tran-astaxanthin within inclusion

2.1.4 包合过程中全反式虾青素包合率试验结果

使用3个批次雨生红球藻粉，按1.2项下方法进行皂化反应后，按1.4项下方法进行包合试验，按1.5项下方法进行含量测定，按1.6项下方法进行包合率计算，结果如下表2所示，雨生红球藻粉皂化产物包合前后全反式虾青素平均包合率为91.0%。

2.1.5 包合物中虾青素的稳定性试验结果

按1.7项方法操作，结果如图4所示，3个批次雨生红球藻粉三个月后平均残存率为52.6%，3批次皂化包合物三个月后平均残存率为95.0%，包合后雨生红球藻皂化提取物比原粉虾青素残存率(%)提高了42.4%，虾青素-环糊精包合物可大大提高虾青素在保存期间的稳定性，达到了药物和保健食品原料的稳定性要求。

图4 全反式虾青素保存率趋势图Fig.4 The trend graph of survival rate of tran-astaxanthin

3 结论

3.1 雨生红球藻粉含有游离虾青素和虾青素酯，由于结合成酯的脂肪酸不同，虾青素酯种类繁多、存在形态各异，在氮气保护、低温、避光、抗氧化剂(BHT)保护条件下，雨生红球藻粉中的虾青素酯在一定浓度的碱性溶液中皂化水解成游离虾青素，皂化水解过程没有明显破坏虾青素的结构与构型。

3.2 皂化反应能提高虾青素β-环糊精包合物的包合率，主要是因为通过皂化反应有效去除雨生红球藻中的油脂，另外皂化反应将原来的虾青素酯水解成游离的虾青素，降低了分子的空间体积和分子量大小，更加符合了包合的要求。

3.3 皂化条件为:温度4℃，氢氧化钾/甲醇溶液0.2 mol/L，每克雨生红球藻粉加入50 mL氢氧化钾/甲醇溶液，反应时间12 h。在此条件下，总虾青素保存率可达90%以上。

3.4 包合条件为:在50℃条件下，2 g红球藻皂化提取物乙醇溶液与10 g β-环糊精水溶液恒温搅拌包合7小时，包合率可达90%以上。

3.5 稳定性试验表明，将雨生红球藻粉皂化后制成虾青素-环糊精包合物可大大提高虾青素在保存期间的稳定性，而且皂化后包合物稳定性与原粉相比显著提高，达到了药物和保健食品原料的稳定性要求。

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7 Jian HL(蹇华丽)，Liang SZ(梁世中)，Song GJ(宋光均)，et al.Study on the preparation of inclusion complex of astaxanthin and β-cyclodextrin.Sci Technol Food Ind(食品工业科技)，2007，(9):84-86.

Feasibility Study on Inclusion Complex of Saponification Product of Haematococcus pluvialis with β-Cyclodextrin

WAN Qing-jia1*，RAO Gao-xiong2，YA Qiao1，ZHANG Qiu-ling1，LONG Xiang11Yunnan Green A Biological Project Co.，Ltd，Kunming 650106，China;2Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China

Feasibility on inclusion complex of saponification product of Haematococcus pluvialis with β-cyclodextrin was studied with astaxanthin content as the quality evaluation criteria.As the results，inclusion rate reached 90%at optimized conditions，and the content of astaxanthin in the saponification of H.pluvialis have no significant change.The stability of astaxanthin reach the requirements as medicine and health food raw materials in the accelerative experiment of stability at 50℃，75%relative humidity.The results showed that this method is feasible.

Haematococcus pluvialis;astaxanthin;saponification;β-cyclodextrin;inclusion rate;stability

1001-6880(2011)04-0700-04

2010-06-12 接受日期:2010-10-28

科技部科技型中小企业技术创新基金无偿资助项目:新型生物反应器大规模培养红球藻生产虾青素技术研究与开发(09C26215302506)

*通讯作者 Tel:86-871-8325916;E-mail:wanqingjia163@163.com

O641.4;R943

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