丹参水溶性成分的地域分布特点分析

杨新杰，万德光，刘 敏，林贵兵，王金燕，严铸云

成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室，成都610075

丹参水溶性成分的地域分布特点分析

杨新杰，万德光，刘 敏，林贵兵，王金燕，严铸云*

成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室，成都610075

分析全国不同产地丹参中水溶性成分的含量变化情况及其地域分布特点。采用HPLC法测定不同产地丹参水溶性成分的含量，运用SAS统计软件分析丹参水溶性成分相关性及其地域分布特点。回归分析表明，丹参素与丹酚酸A含量呈负相关，原儿茶醛与迷迭香酸含量呈负相关，咖啡酸与丹参素含量呈负相关，丹酚酸B与丹酚酸A、丹参素含量呈正相关。聚类分析表明，三个野生药材与山东和河南大部分产地、四川中江栽培药材水溶性成分较高聚为一类。建议丹参药材中丹参素≥0.14%，原儿茶醛≥0.01%，咖啡酸≥0.01%，迷迭香酸≥0.17%，丹酚酸B≥3.0%，丹酚酸A≥0.01%。丹参的水溶性成分呈现地域性差异，传统道地产区的含量较高。

丹参;丹参素;原儿茶醛;咖啡酸;迷迭香酸;丹酚酸B;丹酚酸A;HPLC

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎，为常用中药材，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效［1］。其主要成分为脂溶性成分和水溶性成分两大类。丹参中水溶性成份主要为丹酚酸类化合物，药理实验证实其具有抗血栓、抗氧化、改善血液循环等作用［2］。近年来，不少学者开展了不同产地丹参的质量评价研究，但不同学者的研究结果各不相同［3-6］。本文采用平行采样和平行分析方法，对四川、山东、河南、河北、陕西、山西、江苏等7省28个主产地的丹参药材，进行了丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A等6种水溶性成分的HPLC分析，为广大药检、药材生产、加工、购销及使用人员提供参考。

1 仪器与材料

Varian Prostar系列高效液相色谱仪:包括Prostar 210泵、Prostar 325二极管阵列检测器和Prostar色谱工作站(美国Varian公司);25 μL手动进样器(上海安亭微量进样器厂);电子天平(Made by Sartorius BP121S);BRANSON SB-2200型超声仪。乙腈(色谱纯，Tedia Company，Inc.)，水为重蒸去离子水，甲酸(分析纯，批号20070815，成都市科龙化工试剂厂)。

原儿茶醛(批号110810-200506)、丹参素(批号110855-200508)、丹酚酸B(111562-200605)、咖啡酸(批号110885-200102)均购自中国药品生物制品检定所。迷迭香酸(批号080406)、丹酚酸A(批号080412)均购自上海融禾医药科技有限公司。

2007年11月在丹参各主产区采集栽培或野生丹参的根(产地情况见表2)。采用平行采样，每份样品为20～25点采集，样品采集后快速运回实验室，经常规加工处理。样品经成都中医药大学严铸云教授鉴定为丹参Salvia mihiorrhiza Bge.的根。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:phenomenex Gemini C18柱(250×4.6 mm，5 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司)

流动相:A相为水-乙腈-甲酸(90∶10∶0.4)，B相为乙腈，梯度洗脱，A相:0～40 min，100% ～70%;B相:0～40 min，0%～30%。

流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL;柱温:室温;检测波长:280 nm。

2.2 对照品的配制

分别精密称取对照品置棕色量瓶中，以甲醇为溶剂，配制成单组分对照品溶液，再配制混合对照品溶液，其中含丹参素116.98 μg/mL、原儿茶醛25.92 μg/mL、咖啡酸37.36 μg/mL、迷迭香酸132.00 μg/ mL、丹酚酸B 2200.00 μg/mL、丹酚酸A 27.20 μg/ mL。

2.3 供试液的制备

取丹参药材粉末(过三号筛)0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水10 mL，密塞，称定重量，加热回流提取2 h，冷却后再称定重量，加水补足减失重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.4 标准曲线的绘制

取上述混合对照品溶液1、2.5、5、10、15、20 μL，按确定色谱条件进样，测定峰面积，进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系Table 1 Linearing of standard compounds

3 方法学考察

3.1 精密度试验

取2.2项下混合对照品连续进样5次，所测原儿茶醛、丹参素、丹酚酸B、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸A六个组分的峰面积的RSD分别为:1.37%、0.82%、1.20%、0.81%、0.88%、1.26%。

3.2 重现性试验

取同一丹参药材，精密称取5份，按2.3项下制备方法处理，进样分析，测得样品中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的RSD分别为1.27%、0.98%、1.59%、1.96%、0.54%和1.18%。

3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液在0、2、4、8、12、24 h进样，测得样品中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的RSD分别为1.55%、1.93%、 0.70%、1.66%、1.94%和1.82%，表明供试品在24 h内稳定。

3.4 回收率试验

精密称取已知含量的丹参样品适量共9份，3份为一组，分别加入3种不同浓度(样品含量的80%、100%和120%)的混合对照品溶液，按2.3项制备方法处理，进样后计算含量。丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的平均回收率分别为 99.55%、98.31%、99.59%、100.29%、99.94% 和 101.13%;RSD分别为2.27%、2.94%、2.44%、1.83%、0.88%和1.64%。

4 实验结果

4.1 样品含量测定

取不同产地丹参药材，按2.3项供试品制备方法处理，进样20 μL分析，结果见表2。

表2 样品测试结果Table 2 Determination results of samples(%，n=4)

22 山西芮城东垆乡(栽培) 0.445 0.032 0.025 0.383 6.28 0.023 23 山西曲沃北董乡(栽培) 0.361 0.027 0.036 0.252 6.05 0.029 24 山西襄汾汾城镇(栽培) 0.254 0.024 0.042 0.381 5.52 0.019 25 陕西商洛元明村(栽培) 0.292 0.035 0.034 0.227 3.47 0.017 26 陕西蓝田玉山镇(栽培) 0.291 0.034 0.034 0.289 7.90 0.048 27 江苏射阳洋马镇(栽培) 0.303 0.028 0.017 0.241 5.11 0.041 28 江苏赣榆门河镇(栽培) 0.283 0.029 0.043 0.347 5.19 0.038

4.2 水溶性成分的相关性分析

采用SAS统计软件对6种丹参水溶性成分进行回归分析，分别得到6种水溶性成分之间的回归模型，其预测值为:

丹参素 =0.00386+4.65027×原儿茶醛 + 0.40554×迷迭香酸 +0.01248×丹酚酸 B－0.74324×丹酚酸A

原儿茶醛 =0.00401+0.1938×咖啡酸 －0.02486×迷迭香酸 +0.08010×丹酚酸 A+ 0.06858×丹参素

咖啡酸 =0.01284+0.04848×迷迭香酸 －0.03343×丹参素－0.59487×原儿茶醛

迷迭香酸=0.03425+0.95231×丹酚酸 A+ 0.83975×丹参素－3.21959×原儿茶醛+2.08220 ×咖啡酸

丹酚酸 B=1.77752+16.72648×丹酚酸 A+ 10.73970×丹参素

丹酚酸A=－0.00028－0.11556×丹参素+ 1.03684×原儿茶醛 +0.08413×迷迭香酸 + 0.00309×丹酚酸B

上式表明，药材中丹参素与丹酚酸A含量呈负相关，原儿茶醛与迷迭香酸含量呈负相关，咖啡酸与丹参素含量呈负相关。说明所测的6种水溶性成分除丹酚酸B外其他5种成分在植物体内存在明显底物和产物的转化关系。

4.3 水溶性成分与地理相关性

用SAS统计软件中的Hierarchical cluster analysis对上述28个产地的丹参以6个水溶性成分含量之和及丹酚酸B的含量为变量进行聚类分析，所用聚类方法为Average linkage，结果见图3。

由图可见，根据水溶性成分的含量，可把样品分为2组，第1组包括1、8、11、16、9、12、20、25、14、21、2、7、10、3、15、17、18、23、27、22、4、5、6、19、26，6个水溶性成分质量分数之和为:3.785～8.596，丹酚酸B质量分数为:3.23～7.9;主要包括安徽、山东、河北、陕西、四川及河南的大部分地区。这与山东、河南、四川中江被认为其道地产区一致，但山东、河南和四川中江的质量也存在差别。第2组包括13、24、28，6个水溶性成分质量分数之和为:3.6～6.24，丹酚酸B质量分数为:3～5.52;主要包括山西、江苏及河南的部分地区。可见丹酚酸B质量分数与丹参中水溶性成分含量之和成正比，所得结论与文献［3］一致。

图3 不同产地丹参水溶性成分的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of Water-Soluble components in Radix Salviae Miltiorrhizae from different sources

5 讨论

5.1 丹参酚酸类成分为水溶性成分，采用水溶液提取为最好［6］。考察了超声提取、回流提取、和索氏提取三种提取方法，结果以回流提取较好;比较回流提取30 min、1、2、3 h，在提取2 h时丹酚酸B的含量最高，随回流时间的增加，有的含量成分增加，推测丹酚酸B出现了转化，故选择回流提取2 h制备样品。这可能是测定结果与文献［3］报道存在一定差异的原因。

5.2 本实验对四川、河南、河北、山西、陕西、山东等地的家种及野生丹参的水溶性成分进行测定，结果表明不同产地的丹参药材的水溶性成分含量存在差异，且同一产地野生丹参药材中所测得成分含量比家种的要高，但各产地样品的丹酚酸B均达到了中国药典的规定。6种水溶性成分中丹酚酸A在各样品中含量差异较大，最大可达7倍。根据测定全国各产地样品结果，建议丹参素≥0.14%，原儿茶醛≥0.01%，咖啡酸≥0.01%，迷迭香酸≥0.17%，丹酚酸B≥2.0%，丹酚酸A≥0.01%;依据道地产区推断古代优质丹参的质量:丹参素≥0.25%，原儿茶醛≥0.025%，咖啡酸≥0.03%，迷迭香酸≥0.20%，丹酚酸B≥6.00%，丹酚酸A≥0.025%。

5.3 采用SAS统计软件统计分析，可知药材中丹参素与丹酚酸A含量呈负相关，原儿茶醛与迷迭香酸含量呈负相关，咖啡酸与丹参素含量呈负相关，丹酚酸B与丹酚酸A、丹参素含量呈正相关。聚类分析结果表明三个野生药材与陕西、山东和河南大部分产地、四川中江栽培药材聚为一类，与历史上出现以河南、山东、四川为道地产区相吻合，这些产地的水溶性成分较高。不同产地的丹参药材质量存在明显差别，故在临床用药时要对药材的来源进行控制。

5.4 本实验对全国主产地的丹参质量进行分析中，采用平行采样和平行分析方法，经分析该次实验结果满足采样和分析质量控制的要求(将另文报道)，表明实验结果客观反应所分析地区药材的质量。

1 State Pharmacopoeia Committee(国家药典委员会) .Chinese Pharmacopoeia(中国药典).Beijing:Chemical Industry Press，2005.52.

2 Xiao PG(肖培根).New Edition of The Chinese Materia Medica(新编中药志).Beijing:Chemical Industry Press，2002.212.

3 Jin ZZ(金樟照)，Zhu M(祝明)，Zhang WT(张文婷)，et al.Studies on relationship between fingerprints of hydrophilic and hydropholic components in Salvia miltiorrhiza.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2004，35:1174-1177.

4 Chen X(陈幸)，Li WS(黎万寿)，Xia WJ(夏文娟)，et al.Comparative study on chemical composition in Radix Salviae Miltiorrhizae origin from Zhongjiang Sichuan and other habitats.J Tradit Chinese Med and Res of Tradit Med(中国中药杂志)，1997，2:522.

5 Zhao LL(赵磊磊)，Xie K(谢凯)，Zhu SS(朱盛山)，et al.Quality analysis of Radix Salviae Miltiorrhizae from different habitats by HPLC and TLC.J Chin Med Mat(中药材)，2007，30:646-648.

6 Sun P(孙丕)，He LY(何丽一).Determination of phenolic acids from plants of Salvia L.by HPLC.J Tradit Chin Med Res Tradit Med(中国中药杂志)，1997，32(Supplement): 26.

Analysis on Geographical Distribution of Hydrophilic Components in Radix Salviae Miltiorrhizae

YANG Xin-jie，WAN De-guang，LIU Min，LIN Gui-bing，WANG Jin-yan，YAN Zhu-yun*
College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicines of Ministry of Education，Chengdu 610075，China

Analyzing the content change of hydrophilic constituents and it’s geographical distribution in Salvia miltiorrhira from different producing area around china.Determining content of hydrophilic constituents in S.miltiorrhira from different producing area by HPLC and using SAS to analyze correlation about hydrophilic constituents in S.miltiorrhira and it’s geogrofic distribution.Regression analysis shows that content of Danshensu and salvianolic acid A present negative correlation，protocatechuic aldehyde and rosemarinic acid present negative correlation，caffeic acid and Danshensu present negative correlation，salvianolic acid B and salvianolic acid A and Danshensu showing positive correlation.Cluster A-nalysis shows that three wild medicinal herbs and the cultivated species in most producing area of Shandong and Hebei province and Zhongjiang in Sichuan are one kind.Their content of hydrophilic constituents are high.We suggested that Danshensu should greater than or equal to 0.14%，protocatechuic aldehyde should greater than or equal to 0.01%，caffeic acid should greater than or equal to 0.01%，rosemarinic acid should greater than or equal to 0.17%，salvianolic acid B should greater than or equal to 3.0%，and salvianolic acid A should greater than or equal to 0.01%.There are differences in hydrophilic constituents in S.miltiorrhira between different producting areas，especially higher in traditional and original location.

Radix Salviae Miltiorrhizae;danshensu;protocatechuic aldehyde;caffeic acid;rosemarinic acid;salvianolic acid B;salvianolic acid A;HPLC

1001-6880(2011)04-0684-05

2009-11-09 接受日期:2010-02-05

国家十一五科技支撑计划项目(2006BAI09B03-4)

*通讯作者 E-mail:cdtcmyan@126.com

R284.1

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