应用电化学测菌法监测粘接性牙周夹板对牙周炎患者龈沟液中细菌定植的影响*

裴振华 施生根 牛忠英 汤楚华 史 亮

牙周炎是菌斑微生物引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，全国口腔健康流行病学调查结果显示我国中老年人牙周健康率仅为14%，在严重危害口腔健康的同时，还可成为中老年人常见全身性疾病如心血管疾病、糖尿病等的重要危险因素，因此中老年人口腔保健的重要性日显突出[1-3]。牙齿松动是牙周炎的主要临床表现之一，松动牙的诊治是牙周、修复治疗的难点。牙周夹板在固定松动牙、维护牙列完整、改善患者咀嚼功能、保持牙周疾病的治疗效果和控制其发展等方面发挥着重要作用[4-6]，但牙周夹板对牙周微生态是否会产生不良影响仍知之甚少。

针对目前检测牙周细菌的细菌培养法和PCR检测技术存在需厌氧操作、耗时长等缺陷[7-9]，本研究旨在利用电化学测量手段的独特优势如检测迅速、测试范围广能够在混浊溶液中进行测试等[10,11]，应用本课题组前期建立的基于液体电极微流芯片的电化学测菌法，检测粘接性牙周夹板固定患者初诊时最深牙周袋位点和健康对照下颌第一磨牙近颊位点，及牙周基础治疗后夹板固定前、固定后2周、固定后4周相应位点龈沟液中的牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌和有益菌血链球菌，并以细菌培养和定量PCR检测结果作为对照，同时记录相应阶段的牙周临床指标包括菌斑指数、牙龈出血指数、探诊深度和临床附着水平的变化，旨在观察粘接性牙周夹板对固定患牙牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌和有益菌血链球菌定植的影响，同时进一步评估电化学测菌法的临床应用价值。

1.材料和方法

1.1 试剂和仪器 聚二甲基硅氧烷(polydime thylsilicone,PDMS)单体和固化剂 Sylgard 184(Dow Corning,USA)；SU-82025光刻胶和显影液(Micro Chem Corp.,USA)；Protein Amicrobeads(50nm in diameter,Miltenyi Biotec,Germany)、P.gingivalis ATCC33277 gingipain K抗血清和血链球菌 ATCC10556抗血清(自备)；去离子水(Milli-Q SP system,USA)；KCl等生化试剂来自北京大学化学院。国产等离子清洗器(PDC-M),阻抗分析仪(Agilent Technologies Inc,USA)，电动注射泵(Harvard,USA)，AB 7500型荧光定量PCR仪(ABI,USA)

1.2 受试患者及其患牙的纳入标准 按Amitage(2000)的诊断标准，选择2010.6-2011.2于解放军第306医院牙周科就诊的慢性牙周炎患者10名，年龄在60-81岁之间；松动牙1-4颗，至少有一颗牙松动Ⅱ-Ⅲ度，牙槽骨吸收超过根长的1/2；松动牙位置：位于下颌前牙区；要求尖牙和前磨牙松动小于Ⅰ度，牙槽骨吸收不超过根长的1/2；无明显错牙合畸形和局部刺激因素；无糖尿病、心血管疾病等系统性疾病，妇女无妊娠；愿意接受牙周系统治疗暨牙周基础治疗和夹板固定修复等；患者本人同意参加本研究，并能够按时随访。

1.3 牙周基础治疗、夹板固定和监测时间 本研究相关的牙周基础治疗、夹板固定和患牙龈沟液细菌监测均由1名副主任医师和1名主治医师完成。

夹板类型：采用Super-bond C&B树脂粘接性夹板(日进齿科，日本)。

监测时间共分四个时间点即初诊(T0)、牙周基础治疗后夹板固定前(T1)、固定后2周(T2)、固定后 4 周(T3)。

1.4 龈沟液采集[12]采集位点：患牙为最深牙周袋位点(2-3个位点)共22个位点取样，健康对照牙均为下颌健康第一磨牙的近颊位点共10个位点；取样部位隔湿、吹干，去除龈上菌斑，将Whatman3MM滤纸条轻轻插入袋内，至有轻微阻力为止。留置30s后取出，即刻放入盛有生理盐水的Eppendorf管中。每个位点间隔20min重复取样一次。

1.5 牙周临床指标记录 依据国际公认标准记录菌斑指数、牙龈出血指数、探诊深度和临床附着水平。

1.6 电化学测菌法量化龈沟液中的牙龈卟啉单胞菌和血链球菌

(1)龈沟液中牙龈卟啉单胞菌和血链球菌的免疫磁分离 Protein Amicrobeads(50nmin diameter,Miltenyi Biotec,Germany)、P.gingivalis ATCC 33277 gingipain K抗血清、血链球菌ATCC1055抗血清用于P.gingivalis的磁分离。具体步骤按照磁珠应用说明书进行，最后将Protein A纳米磁珠-抗体-细菌复合物在去离子水中室温平衡20min待测。

(2)细菌的电阻抗测量 芯片制作和电阻抗测量设备和方法、阻抗-细菌浓度线性关系式拟合方法同前期研究[11,13]。根据阻抗-细菌浓度线性关系式，通过检测样本的电阻抗值推算出样本中牙龈卟啉单胞菌和血链球菌的初始浓度。牙龈卟啉单胞菌为系统相对阻抗变化NIC=-10.33 logC(cells/ml)+58.72，R2=0.96(检测下限为 106cells/ml)，血链球菌为NIC=-8.12 logC(cells/ml)+8.49，R2=0.98(检测下限为104cells/ml)。

1.7 细菌培养 将龈沟液样本进行1∶10倍比稀释至 10-2、10-3、10－4、10-5后，各取 100μl原液和稀释液均匀涂布接种牙龈卟啉单胞菌选择性培养基和血链球菌选择性培养基。37℃厌氧培养，牙龈卟啉单胞菌培养4天，血链球菌培养2天。通过计数接种平板上菌落的平均值计算出细菌数量。

1.8 实时荧光定量PCR检测 细菌模板DNA的提取依据细菌DNA提取试剂盒(Omega,USA)的操作说明进行。

牙龈卟啉单胞菌16s RNA的PCR扩增引物为：上游引物5’TGGTAGTCCACGCAGTAAA-3’，下游引物 5’-TGTCCCTCCCAATGT AAC-3’，片段大小为452bp；实时定量PCR扩增引物为5’-ACCTTACCCGGGATTGAAATG-3’，下游引物 5’-CAACCATGCAGCACCT ACATAGAA-3’，片段大小为83bp。

血链球菌16s RNA的PCR扩增引物为：上游引物 5’-ATTGTTAGTTGCCATCA-3’，下游引物5’-TACCTTGTTACGACTTCACCC-3’,片段大小为390bp；实时定量PCR扩增引物为5’-CCAGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCT-3’，下游引物 5’-ACTCTCGTGGTGTGACGGGCGG TGT-3’，片段大小为130bp。

细菌实时定量PCR扩增反应体系为：2μlDNA模板，引物各0.4μl，1.6μl dNTPs(2.5mM)，10μl REALSYBRMixture(2×)，7.2μl去离子水。PCR扩增循环参数：95°10min，(95℃ 15sec，60℃ 60sec)×40个循环。

1.9 数据处理和统计分析 分别应用OriginLab 8.0软件和利用SPSS13.5软件对实验数据进行处理和统计学分析，统计学检验水准α=0.05。

2.结果

2.1 粘接性夹板固定对P.gingivalis和S.sanguinis定植的影响 电化学测菌法、细菌培养和实时定量PCR三种方法检测粘接性牙周夹板患牙和健康对照牙相应位点龈沟液中牙龈卟啉单胞菌和血链球菌的结果，如附表所示。应用电化学测菌法检测，初诊样本中两种菌的检出率达100%，牙周基础治疗后相应位点中两种菌的数量均在检测下限以下；电化学测菌法获得的细菌数量显著少于实时定量PCR(P=0.00)，与细菌培养相比无统计学差异(P=0.43)。电化学测菌法的检测结果与细菌培养、定量PCR检测结果之间呈正相关关系(P=0.00)。

在患牙检测位点，牙周基础治疗后牙龈卟啉单胞菌的数量较初诊时显著减少，差异有高度统计学意义(P=0.00)。夹板固定期间(T2、T3)牙龈卟啉单胞菌的数量均低于检测下限106cells/ml，且与固定前T1相比差异无统计学意义(P=1.00)；在健康牙位点，牙龈卟啉单胞菌的数量改变趋势同患牙检测位点，如图1所示。

在患牙检测位点，牙周基础治疗后血链球菌的数量较初诊时减少，差异有统计学意义(P=0.02)。夹板固定期间(T2、T3)血链球菌的数量与固定前T1相比差异无统计学意义(P=0.98)；在健康牙位点，牙周基础治疗后血链球菌的数量较初诊时减少(P=0.00)，与固定前T1相比，夹板固定后2周T2血链球菌的数量即增加，但差异无统计学意义(P=0.55)，夹板固定后4周T3血链球菌的数量显著增加(P=0.00)如图2所示。

细菌培养和定量PCR检测结果显示血链球菌/牙龈卟啉单胞菌的比值在T0、T1、T2、T3期总体上呈逐渐上升的趋势，如图3、图4所示。

2.2 粘接性夹板固定对牙周临床指标的影响

实验结果显示牙周系统治疗后炎症部位的菌斑指数(图5)，牙龈指数(图6)，探诊深度(图7)和临床附着水平(图8)均有明显改善。夹板固定期间(T2、T3)虽然个别部位的菌斑指数和龈出血指数较夹板固定前T1升高，但与初诊相比，仍有明显改善。

3.讨论

老年人牙周病发病率高，防治重点除定期的牙周基础治疗外,可结合各类夹板和各种固定方式保证松牙的稳定,有利牙齿的保留,延长使用寿命，改善咀嚼和消化吸收功能，从而对提高老年人的生活质量，保证老年人的身心健康，减轻社会医疗负担有重要作用。但是夹板修复体在控制炎症的同时可从多个方面影响到牙周的微环境：①妨碍口腔清洁的修复体易则造成菌斑滞留，②某些修复材料的表面较自然牙更易于菌斑聚集和微生物的生长，③牙周膜内细胞的分泌及其代谢产物受修复体咬合暨牙周组织应力的调控。而牙周微环境可以对局部牙周微生物的种类和数量产生广泛的影响[14]。据报道，圆锥型套筒冠义齿夹板戴入后龈下菌斑中牙周致病菌数量增加，但与非固定组比，患牙牙周炎临床指标的控制较好[15,16]。本实验利用电化学测菌法检测夹板固定不同时间炎症和健康位点龈沟液中的牙龈卟啉单胞菌和血链球菌，结果显示牙周基础治疗后以及在整个夹板固定后的观察期间，牙龈卟啉单胞菌和血链球菌细菌数量显著下降,牙龈卟啉单胞菌的数量基本均在检测下限以下。由于受检测下限所限，部分阻抗数据不能获得，所以不能记录通过电化学测菌法获得的两种菌的比值变化。但是细菌培养和定量PCR的检测结果在进一步验证了电化学测菌法的检测结果基础上，结果显示有益菌血链球菌与致病菌牙龈卟啉单胞菌的比值呈上升的趋势，从而在一定程度上表明该粘结性牙周夹板短期内不会对夹板固定患牙牙周微环境中致病菌牙龈卟啉单胞菌和有益菌血链球菌的定植产生不良影响。

附表 粘接性牙周夹板患者不同时期龈沟液中牙龈卟啉单胞菌和血链球菌的数量(均数±标准差)

图1 P.gingivlis的电化学测菌法检测结果

图2 S.sanguinis的电化学测菌法检测结果

图3 血链球菌/牙龈卟啉单胞菌的比值(细菌培养法)

图4 血链球菌/牙龈卟啉单胞菌的比值(实时定量PCR法)

图5 粘接性夹板固定患牙炎症位点不同观察期的菌斑指数变化

图6 粘接性夹板固定患牙炎症位点不同观察期的牙龈指数变化

图7 粘接性夹板固定患牙炎症位点不同观察期的探诊深度变化

图8 粘接性夹板固定患牙炎症位点不同观察期的临床附着水平变化

传统用于牙周细菌定量检测的方法主要是细菌培养和定量PCR，本实验应用本课题组前期建立的电化学测菌法检测牙龈卟啉单胞菌和血链球菌，主要是针对传统方法检测条件苛刻、检测周期长、检测成本高等缺陷，充分利用电化学测菌法呈现出的样本处理较简单、检测迅速、检测成本低等优势，结果显示与细菌培养和定量PCR量化结果比较，尽管牙周基础治疗后，由于细菌数量低于检测限，电化学测菌法不能获得细菌的准确数量，但总体样本检测结果分析，电化学测菌法的量化结果与细菌培养、定量PCR量化结果之间仍是正相关关系；且在检测细菌数量相对多的初诊龈沟液样本时，电化学测菌法的量化结果与细菌培养、定量PCR量化结果高度正相关。由此表明当牙龈卟啉单胞菌和血链球菌数量在检测下限以上时，电化学测菌法可在一定程度上代替细菌培养和定量PCR方法用于临床实际样本中细菌的定量检测。

本实验选择Super-bond C&B树脂粘接剂制作粘结性牙周夹板,是紧密结合了老年人口腔治疗的特殊性,例如老年人多不能一次耐受长时间的口内操作,全身因素导致的行动便利性下降，多数不接受过多的牙齿预备，由于不需做牙体预备，固定强度强，操作简便，操作时间短，减少了老年患者的不适感。另一方面粘接剂凝固前流动性好，制作时不易造成松动牙的病理性移位,易塑形，形成良好邻间隙，有利于自洁。由于病例资料的相继流失,本实验没能够获得所有病例的较长期完整观察结果,但是本实验现阶段结果显示炎症部位的菌斑指数，龈出血指数，牙周探诊深度和临床附着水平均有明显改善。夹板固定期间虽然个别部位的菌斑指数和龈出血指数较夹板固定前升高，但与初诊相比，仍有明显改善。

综上所述，利用牙周夹板进行老年牙周炎患者的松动牙固定，对改善口腔和促进全身健康具有重要意义，粘结性牙周夹板短期内不会对老年患者牙周微环境中的致病菌牙龈卟啉单胞菌和有益菌血链球菌的定植产生不良影响，且操作时间和夹板固定效果患者接受度好，但有关牙周夹板对固定患牙牙周微生态影响的长期效应还有待进一步观察研究。

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