维药没食子对牙釉质脱矿与再矿化作用的扫描电镜观察*

李新尚 冯锦虹 林 静 赵 今

没食子作为维吾尔药防龋特色和代表药物之一，有其独特的疗效，在新疆民间被百姓做为预防龋病的常用药物，以往防龋作用的研究多采用简单的汤、丸、散和膏等粗糙剂型，而现有的一些研究不够系统深入，尚未得到认可和广泛应用。本研究组前期的研究表明没食子主要化学成分—没食子鞣质及其有效提取物可以有效抑制变形链球菌的生长，抑制龋病的发展，其毒副作用较氟化物轻微，有望成为一种新型防龋药物[1]。牙齿脱矿的过程是致龋的重要方面，目前其在矿化领域研究尚未见报道，本研究的目的是通过扫描电镜观察维药没食子对牙釉质表面的矿化作用，探讨没食子在矿化方面防龋的作用机制，为没食子的临床应用研究奠定理论和实验基础。

1.材料和方法

1.1 实验材料 没食子(Aleppo gall)(由新疆哈博维药厂提供)，荧光光度计(RF-5301pc型，日本岛津公司)，控温磁力搅拌器(85-2型，江苏金坛市医疗仪器厂)，氟化钠(天津市达净化材料精细化工厂，分析纯)，叠氮钠(天津市福晨化学试剂厂，分析纯)，氯化钙(天津市致远化学试剂有限公司，分析纯)，硝酸钙、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钾(天津市盛鑫精细化工有限公司，分析纯)，醋酸(天津市永昴精细化工有限公司，分析纯)、HEPES(solarbio)，PH调节计(PB-10型，sartorius)，体视显微镜(Nikon，日本)，超声波清洗机(KQ-200KDE型，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 釉质的预备 选择新鲜拔除的牛切牙，除去表面有机污染物，分离冠根，冠部超声清洗，干燥，体视显微镜下观察无龋损、氟斑、裂痕。用硬组织切割机将牙冠切成10mm×10mm×2 mm大小的釉质块，唇面釉质用抛光机及碳化硅砂纸在流水下依次磨平、抛光。选择釉质块120个，超声清洗，自然干燥，釉质块表面开窗9mm×9mm大小，其余部位涂布两层抗酸指甲油。将120个釉质样本随机分为脱矿实验组和再矿化实验组，每组各60例。脱矿液及再矿化液具体配置如下，脱矿液：2.2mmol/LCa(NO3)2，2.2mmol/LKH2PO4、50mmol/L醋酸，1.0mmol/L NaN3，0.1mg/L NaF，用5mol/L的KOH调至pH为4.5。再矿化 液 :1.5mmol/L CaCl2，0.9mmol/L KH2PO4，130mmol/L KCl，1mmol/L NaN3，20mmol/L HEPES，pH=7.0。

1.3 脱矿实验 将预备好的60例釉质标本用嵌体蜡固定在自制的环形玻棒上，放入盛有脱矿溶液的玻璃器皿中，设置釉质表面与溶液的比20mm2/10ml，磁搅拌仪搅拌(100r/min)，60个釉质样本，随机分为3组(20个/组)，设为氟化钠组(阳性对照)、没食子组、去离子水组(阴性对照)，将各组标本放入脱矿液中，加入各组干预药物，观察各组药物对脱矿过程的影响作用。通过MIC实验，设置没食子和去离子水浓度为4mol/L，氟化钠浓度1mol/L，37℃脱矿作用3d。脱矿前后均选取样本做扫描电镜观察，分析药物作用效果的差异。

1.4 再矿化实验 首先将，牛牙样本制备为人工龋标本，具体方法为将预备好的60例釉质标本用嵌体蜡固定在自制的环形玻棒上，放入盛有脱矿溶液的玻璃器皿中，釉质表面与溶液的比率为20mm2/10ml，磁搅拌仪搅拌(100r/min)，37℃脱矿3天，形成人工龋样本。

随后将人工龋样本后随机分为3组(20个/组)，即:氟化钠组(阳性对照)、没食子组，去离子水组(阴性对照)。没食子和去离子水浓度为4mol/L，氟化钠浓度为 1mol/L，再矿化液用2mol/LNaOH将pH调至7.0.然后各组分别进行pH循环实验，共循环12d，其每天的具体方案[2]见附表。

附表 再矿化pH循环实验方案

2.结果

2.1 脱矿组扫描电镜观察 由电镜图可见，正常牙齿表面较为平整(图1)，去离子水干预脱矿后，牙齿表面凹凸不平(图2)，氟化钠处理后，可见牙齿表面虽有不平但可见细密的颗粒(图3)。没食子处理后，表面也可见细密的颗粒(图4)。电镜图示去离子水不具有抑制釉质脱矿的作用，氟化钠及没食子能使脱矿釉质表面颗粒再附着，具有抑制脱矿的作用。

2.2 再矿化组扫描电镜观察 扫描电镜结果显示，正常釉质表面较为平坦(图5)。经脱矿后形成人工龋模型可见表面大小不等的凹坑(图6)。在人工龋的基础上，经氟化钠干预的再矿化循环后，可见细密的颗粒附着，牙齿表面较为平坦(图7)。经没食子作用的再矿化循环后，可见颗粒附着，牙面已恢复较为平整，没食子有着色作用，电镜片颜色较为发暗(图8)。经去离子水作用的再矿化循环后，可见牙面较脱矿后图平整度有所恢复，凹坑变小(图9)。电镜图片显示氟化钠及没食子具有促进再矿化作用，但外观不如氟化物组那样规则、均匀(图 7-8)。

图1 正常牙釉质表面电镜图

图2 去离子水干预后脱矿釉质表面电镜图

图3 氟化钠干预脱矿后釉质表面电镜图

图4 没食子干预脱矿后釉质表面电镜图

图5 正常牙釉质表面电镜图

图6 脱矿后牙釉质表面电镜图

图7 氟化钠作用于PH循环后电镜图

图8 没食子作用于PH循环后电镜图

图9 去离子水作用于PH循环后电镜图

3.讨论

龋病已被公认为世界上一种最常见的慢性感染性疾病[3]。世界卫生组织已将其列为仅次于心血管疾病和肿瘤，位居危害人类的第三位疾病。如何寻找有效地、毒副作用轻微的防龋药物，逐渐成为研究的热点。没食子属于新疆本土天然药物，取材方便、价格低廉，前期研究证实其对变形链球菌有抑制作用[4]。实验从该药矿化领域角度进行研究，如果明确药物疗效，将会推动没食子走向临床，造福于广大的龋病患者。本实验采用新鲜的离体牛牙作为人牙的替代者，因为牛牙易获取、其结构与理化性质与人牙非常接近，用它代替人牙已经成为国内外学者广为接受的选择[5]。实验前期研究发现没食子对致龋密切的变形链球菌具有一定的抑制作用[6]，本实验采用体外脱矿及再矿化化学模型—pH循环，模拟了受致龋因素作用，釉质周围pH值迅速下降，随后在唾液缓冲系统中缓慢回升的过程[7]。较为真实的再现了口内环境。

牙齿每天都在进行脱矿和再矿化的过程，保持一个动态平衡。平衡一旦打破，将会导致牙体硬组织脱矿的加重或减轻[8]。脱矿是由于菌斑下的致龋菌在代谢过程中产酸，造成局部微环境的pH值下降，导致硬组织脱矿，羟磷灰石晶体溶解破坏，无机钙、磷移出所致[9]。再矿化是钙、磷和其它矿物离子沉积于正常或部分脱矿的牙釉质内或釉质表面的过程。在此过程中，如果脱矿占主导作用，将会导致牙体硬组织缺损。反之，如果再矿化占主导作用，牙体硬组织处于一个被修复的过程。药物只要对脱矿过程有抑制或对再矿化过程有促进作用，那么这个药物就对牙体矿化方面有积极作用，进而抑制龋病的发生发展。实验采用扫描电镜观察结果证实在脱矿试验中，相同的脱矿条件下，氟化钠及没食子作用后牙表面可见明显的颗粒附着，去离子水未见，说明源于氟化钠及没食子具有抑制釉质脱矿的作用。再矿化实验中，氟化钠、没食子、去离子水作用后，牙体表面平整度都有不同程度的恢复。去离子水作为阴性对照，本身不具有再矿化的作用，牙体表面较脱矿后有所恢复，说明是单纯再矿化液的作用，没食子及氟化钠明显优于去离子水，没食子颗粒沉积的平整度较氟化钠略差一点，两者图片非常接近。两实验结果一致，说明没食子对釉质矿化效果较氟化钠接近，是氟化钠良好的替代药物。

目前关于药物防龋现有研究，其抑龋的机制均不甚明了。通过扫描电镜观察维药没食子，从形态学角度证实了其在矿化方面的积极作用。但其产生、发展的机制仍不清楚，通过实验观察，其再矿化及脱矿抑制主要发生在表层和表层下,故推测没食子矿化的作用机制可能是鞣酸与溶液中的钙离子发生反应形成络合物,通过釉质表面微孔道渗透进龋损内部,促进钙离子沉积,从而引导部分溶解晶体增长促进了再矿化及抑制脱矿，尚需进一步实验加以证实。

[1]牛巧丽，哈木拉提·吾甫尔，赵 今，等.天然药物没食子和联合氟制剂预防龋病的动物实验研究[J].科技导报，2009,27(24):61-66

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[3]Jørn A.Aas，Ann L.Griffen，Sara R.Dardis,et al.Bacteria of dental caries in primary and permanent teeth in children and young adults[J]. Journal of clinical microbiology,2008，6(4)：1407-1417

[4]林 静，赵 今，朱 明，等.没食子鞣质联合氟化钠对不同状态变链菌葡萄糖基转移酶活性的影响[J].中华老年口腔医学杂志，2010，8(5)：315-318

[5]楚金普，郝玉庆，李继遥，等.两种脱矿体系制备人工龋损的病理学比较[J].中国比较医学杂志，2008，18(1)：23-26

[6]赵 今，牛巧丽，李 艳，等.没食子及提取物对主要致龋细菌生长的实验研究[J].科技导报，2009，27(7)：24-28

[7]聂 琳，李 雪，胡德渝.臭氧对脱矿釉质再矿化的实验研究[J].中华口腔医学杂志，2007，42(2)：102-105

[8]Coulthwaite L,Pretty IA,Smith PW,et al.The microbio logicalorigin of fluorescence observed in plaque on dentures during QLF analysis[J].Caries Res,2006:40(2):112

[9]冯 岩，尹 伟，胡德渝.定量光导荧光技术评价光滑面早期龋损再矿化时间的临床研究[J].实用口腔医学杂志,2008,24(4):563-566