反相高效液相色谱法测定乌金胶囊中绿原酸的含量

费 扬，王 慧， 凌水花， 张国庆，张祖艳

(1.第二军医大学东方肝胆外科医院药材科，上海 200438； 2.上海沪丰生物科技有限公司，上海 200433)

反相高效液相色谱法测定乌金胶囊中绿原酸的含量

费 扬1，王 慧1， 凌水花1， 张国庆1，张祖艳2

(1.第二军医大学东方肝胆外科医院药材科，上海 200438； 2.上海沪丰生物科技有限公司，上海 200433)

目的建立反相高效液相色谱法测定乌金胶囊中绿原酸含量，并应用于该制剂质量控制。方法使用Agilent extend-C18柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm)，乙腈-0.1%甲酸(8:92)为流动相，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，检测波长327 nm，测定5批乌金胶囊中绿原酸含量。结果绿原酸在2.04 ～102 μg/ml(r=0.999 9)范围内具有良好线性。加样回收率104.68 %，RSD=1.43%(n=6)。5批乌金胶囊中绿原酸含量在55.08～83.31 μg/g之间。结论该方法灵敏、准确，适用于乌金胶囊绿原酸含量测定。

反相高效液相色谱法；绿原酸；乌金胶囊；含量测定

乌金胶囊是我院临床用于原发性肝癌的辅助治疗制剂，由乌骨藤、郁金、延胡索等5味中药制成。该制剂功能主治：清热解毒，活血化瘀，益气止痛。用于痈肿痉毒、痰湿积聚、血瘀气滞、胸胁胀痛诸症。

乌骨藤为该制剂君药，乌骨藤系萝藦科牛奶菜属植物通光藤Marsdeniatenacissima(Roxb)WightetAm的藤茎，其性味苦，微寒，具有清热解毒、止咳平喘、消炎镇痛等功效，药理研究表明其具有明显的抗肿瘤、免疫调节、保肝利尿、败毒抗癌等作用，对胃癌、肝癌等多种肿瘤具有确切的疗效[1]。绿原酸是乌骨藤主要有效成分之一，具有抗癌变，抗菌，抗病毒等作用。目前乌骨藤及其制剂中绿原酸的含量测定方法主要有高效液相色谱法[2，3]及高效毛细管电泳法[4]。笔者建立反相高效液相色谱法测定乌金胶囊中绿原酸含量，方法准确，重现性好，可用于乌金胶囊质量控制。

1 仪器和试药

1.1仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二级管阵列检测器、Chemstation 色谱工作站、METYLER AE240型电子天平、超声发生器(50KHZ.120W)。

1.2试药 乌金胶囊由第二军医大学附属东方肝胆外科医院制剂室生产，批号： 20100401、20100701、20100901、20101101、20110101；绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：110753-200413；甲醇、乙腈及甲酸为色谱纯 ，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Agilent extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为乙腈-0.1%甲酸(8:92)； 流速1.0 ml/min；检测波长327 nm；进样量5 μl；柱温30 ℃。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品10.2 mg，置10 ml容量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀得浓度1.02 mg/ml母液，置4 ℃冰箱保存。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取乌金胶囊内容物10 g，置于锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，浸泡15 min，超声30 min，放冷，用50%甲醇溶液补足减少的重量，摇匀，过滤。经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1系统适用性实验 按2.1项的色谱条件下，以对照品溶液,样品溶液分别进样，根据色谱参数计算系统适应性。样品中绿原酸保留时间是12.564 min，拖尾因子1.005，理论塔板数大于5 000，分离度大于3.0。对照品和样品的色谱图见图1。

图1 对照品(A)和制剂样品(B)HPLC色谱图

2.3.2标准曲线及线性 配制绿原酸对照品浓度为2.04、5.1、10.2、25.5、51、102 μg/ml，以色谱峰面积(Y)对对照品浓度(X)进行线性回归，得线性方程为：Y=8.472 1X-3.415，r=0.999 9，表明绿原酸在2.04 ～102 μg /ml范围内线性关系良好。

2.3.3检测限及定量限 精密量取绿原酸对照品溶液适量，以信噪比3:1计，检测限为0.68 μg/ml，以信噪比10:1计，定量限为2.04 μg/ml。

2.3.4精密度 在2.1项下色谱条件下，取5.1、25.5、102 μg /ml低、中、高3个浓度对照品溶液在1 d内连续进样5次，RSD分别为1.21%、0.69%和0.24%。

2.3.5稳定性 取乌金胶囊，批号：20100901，按2.2.2项下制备样品，分别考察样品室温放置8 h及4 ℃放置24 h测定结果，RSD均小于2%(n=3)。

2.3.6重复性 取乌金胶囊，批号：20100901，按2.2.2项下制备6份样品，按2.1的色谱条件进样，绿原酸峰面积RSD为1.98 %。

2.3.7加样回收率 取乌金胶囊(批号：20100901)6份，每份10 g，分别精密加入浓度为0.79 mg/ml的对照品2 ml, 按照2.1的色谱条件进样，进样量为5 μl，计算回收率，平均回收率为104.68%，RSD为1.43%。

2.4样品测定 按2.2.2制备供试品溶液，进样分析，记录色谱峰面积，测定5个批次乌金胶囊，结果见表1。

3 讨论

3.1提取溶剂及超声提取时间 由于绿原酸是极性较强的有机酸，提取溶剂比较了纯甲醇及50%甲醇超声提取，结果50%甲醇比纯甲醇提取含量高近10倍，超声时间分别考察15、30、60 min，实验结果表明，超声30 min已能完全提取。

表1 5批乌金胶囊中绿原酸含量测定结果(n=3)

3.2流动相的选择 分别考察了水相中加0.1%磷酸及0.1%甲酸，结果显示样品保留时间及峰型均适宜，由于考虑到长时间进样，磷酸对系统影响更大，故采用乙腈-0.1%甲酸=(8:92)为流动相。

3.3测定结果 考察了5个批号乌金胶囊中绿原酸含量，含量在55.08～83.31 μg/g之间，为制定该制剂质量控制指标提供参考依据。

[1] 张家俊，胡德禹 ，宋宝安，等.乌骨藤化学成分和生物活性研究进展[J].贵州大学学报，2007，3(24)： 213.

[2] 于文静，王焕群.HPLC法测定消癌平口服液中绿原酸的含量[J].中国药品标准，2006，3(7)：50.

[3] 王月敏 ，夏素霞，于绍军，等.乌骨藤药材中绿原酸的含量测定方法研究[J].中国实验方剂学杂志，2007，7(13)：12.

[4] 赵陆华，相秉仁 ，谭喜莹.高效毛细管电泳法测定乌骨藤药材及其制剂中绿原酸的含量[J].中国现代应用药学杂志,2008,4(25)：152.

2011-06-27

[修回日期]2011-10-20

DeterminationofchlorogenicacidcontentinwujincapsulebyRP-HPLC

FEI Yang1，WANG Hui1, LING Shui-hua1, ZHANG Guo-qing1,ZHANG Zu-yan2

(1. Department of Pharmacy, Eastern Hepatobilliary Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438，China; 2. Shanghai Hufeng biology technology Co, Ltd , Shanghai 200433，China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for determination of chlorogenic acid in wujing capsule.MethodsAgilent extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)column was used. The mobile phase was acetonitrile: 0.1%formic acid (8:92). The flow rate was 1.0 ml/min, and the temperature was at 35 ℃. The detection wavelength was 327 nm. Determination of chlorogenic acid in wujin capsule of 5 batches of preparations.ResultsThe calibration curve was at the range of 2.04～102 μg/ml(r=0.999 9), and the average recovery was 104.68 %，andRSDwas 1.43%(n=6).5 batches of chlorogenic acid contents in wujin capsule were between 55.08～83.31 μg/g.ConclusionThe method was sensitive and accurate, and could be used for the quality control of wujin capsule.

RP-HPLC; chlorogenic acid; wujin capsule; content determination

费 扬(1982-)，女，药师.E-mail:feiyangqy@yahoo.com.cn.

张国庆.E-mail:guoqing_zhang91@126.com.

R917

A

1006-0111(2011)06-0460-03