正交试验优选弱视明口服液的提取工艺Δ

梁学政，陈惠红，唐勇琛，陆玉婷，覃红（.广西柳州市中医院，柳州市54500；.广西中医学院研究生学院008级研究生，南宁市 5000；.广西中医学院007级药学本科，南宁市 5000）

正交试验优选弱视明口服液的提取工艺Δ

梁学政1＊，陈惠红1，唐勇琛1，陆玉婷2，覃红3（1.广西柳州市中医院，柳州市545001；2.广西中医学院研究生学院2008级研究生，南宁市 530001；3.广西中医学院2007级药学本科，南宁市 530001）

目的：筛选弱视明口服液的最佳提取工艺。方法：采用正交试验设计，以总多糖含量、总多糖的转移率、出固率的综合评分为指标，以加水量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，优选煎煮工艺；以浓缩液相对密度、醇沉浓度、静置时间为考察因素，优选醇沉工艺。结果：最佳提取工艺为煎煮3次，第1次1.5h，加8倍水；第2、3次分别为1.0、0.5h，加5倍水；浓缩液相对密度为1.15，醇沉浓度为50%，静置时间16h。结论：该工艺简便，制成成品质量稳定。

弱视明口服液；正交试验；煎煮工艺；醇沉工艺

弱视明口服液是广西柳州市中医院通过临床实践研制出的纯中药制剂，由熟地黄、黄精、枸杞子、陈皮等中药组成，具有益肾填精、养肝明目、开窍宁神之功效，用于儿童神经发育不良，近视、远视、散光等造成的弱视。现代药理证明，熟地黄多糖具有滋阴、益智、增强人体造血机能、调节免疫等作用；黄精多糖具有调节血糖、提高人体免疫功能、抗疲劳等功效；枸杞子多糖具有提高人体免疫功能、降糖降脂、抗疲劳、抗衰老、保肝等功效[1]；而多糖为该制剂主要有效成分。为了更好的控制其质量，为制备工艺提供科学依据，本课题组采用苯酚-硫酸法测定处方中总多糖（以葡萄糖计）的含量，同时还结合总多糖的转移率、出固率作为提取工艺综合评价指标，采用正交试验法对提取工艺进行系统考察，以筛选出最佳工艺。

1 仪器与试药

CAL204电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；UV-1601紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；KR80-2沉淀离心机（上海分析仪器厂）；KDM可调控温电热套（山东鄄城科源仪器设备厂）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；HP-01无油真空泵（上海市跃进医疗器械一厂）。

D-无水葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110833-200904）；熟地黄、黄精、陈皮饮片（广西贵港市绿之源种养发展有限公司，批号均为100601）；枸杞子（广西一致中药饮片有限公司，批号：20100611）；石菖蒲饮片（广西柳州百草堂药业有限公司，批号：20100423）；楮实子饮片（广西万丰药业有限公司，批号：20100225）；5%的苯酚溶液（取苯酚分析纯100g，加铝片0.1g、碳酸氢钠0.05g混合，常压蒸馏，收集182℃馏分。称取该馏分5.0g，置于100mL容量瓶中，加新鲜蒸馏水稀释至刻度，摇匀后置棕色试剂瓶中，即得，冷藏、避光保存）由柳州市中医院药剂科自制；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 煎煮工艺正交试验设计

结合文献报道[2]，以加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）为考察因素，以总多糖含量、总多糖转移率、出固率的综合评分为评价指标，每个因素选择3个水平，采用L9（34）正交设计法对提取工艺进行优化。提取工艺的因素水平见表1。

2.2 煎煮样品液的提取

将处方中各药材粉碎成粗粉，按比例称取适量，根据表1的安排加水煎煮提取，煎煮前用规定量水浸泡20min。煎煮液用纱布滤过后浓缩至170mL，冷却后置于冰箱（7℃）冷藏，即得9份煎煮液，备用。

2.3 总多糖含量测定

2.3.1 葡萄糖对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品40.4mg，置于100mL的量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.404mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液。

2.3.2 标准曲线的制备 精密量取葡萄糖对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分别置于25mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。分别精密量取以上溶液各2.0mL，置于具塞试管中，加5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速沿壁加入浓硫酸5.0mL，混匀，40℃水浴加热20min，置于冷水浴中冷却至室温。用分光光度法在490nm波长处测定吸收度（另用纯化水随行做空白）。以葡萄糖浓度（X）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝15.571X+0.026（r＝0.9998）。结果表明，葡萄糖检测浓度在0.00808～0.04848mg·mL-1范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.3.3 测定波长的选择 参考文献方法[5]，以蒸馏水为空白，按“2.3.2”项下方法试验，于280～600nm波长范围内扫描，葡萄糖对照品在490.0nm波长处有最大吸收，故选择490.0nm为最大吸收波长。

2.4 煎煮工艺优选

精密量取“2.2”项下煎煮液10.0mL，置于50mL量杯中，搅拌下缓慢加入95%乙醇使含醇量达50%，冷藏，静置过夜，过滤，用50%乙醇10mL洗涤2次，取滤液回收乙醇至无醇味，再置于水浴浓缩至稠膏状，加80%乙醇20mL分次溶解，摇匀，离心，倾出上清液，沉淀用80%乙醇洗涤2次，收集沉淀物体，加水溶解，转移并定容至100mL量瓶中。精密吸取该溶液5.0mL于25mL量瓶中，定容，作为供试品溶液。精密吸取该供试品溶液2.0mL，按“2.3.2”项下方法操作，测定总多糖含量。并按下式计算总多糖含量的百分比、总多糖转移率、出固率以及综合评分：总多糖含量的百分比＝总多糖含量×供试品溶液总体积/供试品溶液总体积×供试品溶液密度。总多糖转移率＝总多糖含量×供试品溶液总体积/处方中药材总多糖的量；出固率＝供试品干浸膏量/处方总药材量；综合评分＝总多糖含量的百分比×0.2+总多糖转移率×0.6+出固率×0.2。煎煮工艺正交试验结果见表2；煎煮工艺方差分析结果见表3。

由表2、表3可知，因素B、C对煎煮工艺的影响极显著，因素A的影响也具有显著性，影响程度依次为B＞C＞A，因而确定最佳煎煮工艺为A2B2C3，即煎煮3次，第1次1.5h，加8倍水；第2、3次分别为1.0、0.5h，加5倍水。

2.5 醇沉工艺研究

2.5.1 醇沉工艺正交试验设计 本试验以浓缩液相对密度（A）、醇沉浓度（B）、静置时间（C）为考察因素，每个因素选择3个水平，采用L9（34）正交设计法对醇沉工艺进行优化。醇沉工艺因素水平见表4。

2.5.2 醇沉样品溶液的制备 根据最佳煎煮工艺制备9份煎煮液，分别浓缩至相对密度为1.05、1.10、1.15，冷却后边搅拌边缓慢加入95%的乙醇，使含醇量分别达到50%、60%、70%。然后按要求静置不同时间，抽滤，弃去沉淀，取滤液回收乙醇，然后浓缩至比重为1.06，即得9份样品溶液。

2.5.3 醇沉工艺的优选 精密量取醇沉样品溶液适量，按“2.4”项下方法计算总多糖转移率、出固率以及综合评分，并以此为评价指标，优选醇沉工艺。醇沉工艺正交试验结果见表5；醇沉工艺方差分析结果见表6。

由表5、表6可知，因素A、B对醇沉工艺的影响有极显著性，而因素C无影响，其影响程度依次为A＞B＞C。为了缩短生产时间，确定最佳醇沉工艺为A3B1C2，即浓缩液相对密度为1.15，醇沉浓度为50%，静置时间16h。

表1 提取工艺的因素水平Tab 1 Factors and levels of extraction technology

表2 煎煮工艺正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal experiment of decoction technology

表3 煎煮工艺方差分析结果Tab 3 Analysis of variance of decoction technology

表4 醇沉工艺因素水平Tab 4 Factors and levels of alcohol precipitation technology

3 讨论

用苯酚-硫酸法测定总多糖含量，重现性和加样回收率相对不稳定，为了得到理想的结果，笔者考察了试验中葡萄糖对照液、苯酚、浓硫酸的加入比例，以葡萄糖对照液∶苯酚∶浓硫酸按0.5∶1∶5、1∶1∶5、2∶1∶53比例进行反应，然后对其回收率进行考察，当试剂加入比例为2∶1∶5时，回收率较高，且重现性较好。故确定试剂的加入比例为2∶1∶5。

有报道[3]，试验中浓硫酸的加入方法有垂直和沿壁加入，采用上述方法，以样品的重复性和稳定性为考察指标，观察浓硫酸加入法对结果的影响，沿壁加入法重复性较好，但是必须等待其反应完全后（约20min）才能得出相对准确的测量值。

试验样品用80%乙醇处理，消除了亲脂性杂质、单糖、低糖及苷类成分的干扰，故可纯化多糖。

表5 醇沉工艺正交试验结果Tab 5 Results of orthogonal experiment of alcohol precipitation technology

表6 醇沉工艺方差分析结果Tab 6 Analysis of variance of alcohol precipitation technology

[1] 陈 晔，孙晓生.黄精的药理研究进展[J].中药新药与临床药理，2010，21（3）：328.

[2] 潘林梅，陈 峰，薛博渝.正交设计优选兰豆颗粒的水提工艺研究[J].江苏中医药，2003，24（11）：346.

[3] 李 辉，罗佳波.苯酚-硫酸法测定围乐颗粒中总多糖的含量[J].中国药房，2008，19（9）：685.

Optimization of the Extraction Technology of Ruoshiming Oral Solution by Orthogonal Design

LIANG Xue-zheng，CHEN Hui-hong，TANG Yong-chen（Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine of Guangxi Region，Liuzhou 545001，China）
LU Yu-ting（Postgraduate Student of Grade 2008，School of Graduate，Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning 530001，China）
QIN Hong（Pharmacy Major of Grade 2007，Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning 530001，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Ruoshiming oral solution.METHODS：An orthogonal test was adopted in this study.The decoction technology was optimized with the transfer and dry material rates of total polysaccharides as index and using amount of water，decoction time and times as factors.The alcohol precipitation technology was optimized using relative density of concentrate，alcohol precipitation concentration and deposit time as factors.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows：the herb medicines were extracted for 3times，1.5hour with 8times of water for the first time，1.0hour with 5times for the second time；0.5hour with 5times for the third time.The optimal alcohol precipitation process was as follows：relative density of concentrate of 1.15，precipitation concentration of 50%，the alcohol deposit for 16hours.CONCLUSION：The technology is simple and preparation is stable in quality.

Ruoshiming oral solution；Orthogonal experiment；Decoction technology；Alcohol precipitation technology

R283.61；R284.2

A

1001-0408（2011）31-2914-03

Δ广西壮族自治区卫生厅中医药医院制剂类课题（GZYZ-10-39）

＊主任药师。研究方向：中药制剂、药事管理。电话：0772-2309351。E-mail：lxuezheng@163.com

2011-03-21

2011-05-06）