戊四氮致痫大鼠脑神经型钙黏附素和神经营养因子-4表达的变化及灵芝孢子粉的干预作用*

王芳芳, 王淑秋， 邵 帅, 刘 蕾, 刘君星, 马小茹, 梁衍锋, 王淑湘, 张建华

(佳木斯大学 1基础医学院病理生理学教研室，2附属第二医院，3小儿神经康复实验室,黑龙江 佳木斯 154007)

戊四氮致痫大鼠脑神经型钙黏附素和神经营养因子-4表达的变化及灵芝孢子粉的干预作用*

王芳芳1,3, 王淑秋1△， 邵 帅2, 刘 蕾1, 刘君星1, 马小茹1, 梁衍锋1, 王淑湘1, 张建华1

(佳木斯大学1基础医学院病理生理学教研室，2附属第二医院，3小儿神经康复实验室,黑龙江 佳木斯 154007)

目的： 观察戊四氮致痫大鼠脑神经型钙黏附素(N-cadherin)和神经营养因子-4(NT-4)表达的变化及灵芝孢子粉的干预治疗作用，研究癫痫的发病机制及灵芝孢子粉的作用机制。方法健康雄性Wistar实验大鼠30只，随机分为正常对照组、癫痫模型组和灵芝孢子粉治疗组，每组10只。模型组和治疗组均用致痫亚惊厥剂量的戊四氮(PTZ)腹腔注射制作Wistar大鼠慢性点燃模型。在低温条件下迅速取脑，通过免疫组化和Western blotting检测皮质和海马区N-cadherin和NT-4的变化。结果实验性癫痫大鼠模型制作成功，灵芝孢子粉组和癫痫模型组实验动物均达到点燃标准，与癫痫模型组动物相比，灵芝孢子粉组大鼠潜伏期明显延长,但持续时间无显著差异。免疫组化和Western blotting检测实验结果表明：癫痫模型组实验大鼠脑海马和皮质N-cadherin含量比正常对照组增高(Plt;0.01)；灵芝孢子粉组N-cadherins含量比癫痫模型组下降(Plt;0.01)。同时癫痫模型组大脑海马和皮质NT-4含量比正常对照组增加(Plt;0.05)；灵芝孢子粉组NT-4含量比癫痫模型组增加(Plt;0.01)。结论灵芝孢子粉能够降低N-cadherin的表达，调整病变神经元兴奋性，起到抗癫痫作用，还能增强NT-4的表达从而减轻癫痫发作对神经系统的损伤。

癫痫； 戊四氮； 神经型钙黏素； 神经营养因子-4； 灵芝孢子粉

癫痫(epilepsy,EP)是神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症，具有长期性、反复发作性和难治性的特点，严重危害人类的健康。癫痫发生机制是由于大脑皮层神经细胞过度兴奋和(或)过度同步化引起的一系列短暂脑功能失常，是种慢性脑部疾病，具有反复发作、突然发生、突然终止、临床症状表现多样等特点。目前癫痫的治疗仍以药物为主，但是抗癫痫药发展非常缓慢。神经型钙黏附素(N-cadherin)是钙黏附素家族中在中枢神经系统最早发现的成员，是介导Ca2+依赖性细胞与细胞间黏附作用的一种跨膜蛋白，N-cadherin与神经再生和突触重建有直接关系。林华[1]的研究还发现，海马齿状回内分子层N-cadherin可能参与了癫痫后苔藓纤维出芽的过程。神经营养因子-4(neurotrophin-4,NT-4)是1991年在蜂蛇和非洲蟾蛛中发现的低分子量碱性蛋白，以二聚体形式存在。研究证实NT-4在促进神经元的生长、分化与成熟，维持神经元的存活及促进神经损伤后的修复与再生方面发挥着重要的作用[2]。对NT-4的研究发现NT-4不但能减轻缺氧缺血性脑损伤,还能维持神经元的生长存活及保护神经元。这说明N-cadherin及NT-4与癫痫有密切的关系。灵芝孢子粉(Ganodermalucidumspore powder,GLSP)是灵芝的精髓，作为一种珍贵的中药材含有大量的氨基酸和微量元素等营养物质[3-5]，具有提高免疫调节、促进清除自由基、增强机体耐缺氧能力、保护神经系统等功能。本文即探讨灵芝孢子粉干预戊四氮致痫大鼠脑组织N-cadherins和NT-4的含量变化,进一步研究癫痫的发病机制及灵芝孢子粉的作用机制，并为临床上寻求癫痫脑保护剂和低毒高效治疗癫痫的药物提供新的思路和依据。

材 料 和 方 法

1主要试剂与仪器

戊四氮(pentetrazol,PTZ)购自Sigma；灵芝孢子粉购自佳木斯市野生灵芝种植基地；兔抗大鼠N-cadherins、碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG抗体、DAB显色剂、PBS及枸橼酸钠缓冲液、β-actin、组织细胞裂解液、BCIP-NBT显色液、牛血清白蛋白均购自武汉博士德，预染蛋白marker购自MBI。JA型电子精密天平购自上海衡平科学仪器有限公司；BI-2000医学图像分析系统购自成都泰盟生物科技公司。高速低温离心机购自Sigma；EPS-100电泳仪购自上海天能科技有限公司。

2方法

2.1模型制备及动物的处理 健康雄性Wistar大鼠30只，体重180-220 g，由佳木斯大学动物实验中心提供。大鼠随机分为3组：正常对照组、癫痫模型组(PTZ)和灵芝孢子粉给药组(PTZ+GLSP)，每组10 只。参看Morgan等[6]的方法并略加变动。PTZ用前以生理盐水新鲜配制成溶液(10 g/L)。灵芝孢子粉给药组和癫痫模型组给予PTZ亚惊厥剂量(35 mg/kg)腹腔注射，每天1次，持续28 d；正常对照组用等容生理盐水代替PTZ腹腔注射。灵芝孢子粉给药组腹腔注射PTZ的同时再经灌胃给予灵芝孢子粉(150 mg/kg)(灌胃前禁食6 h)，每天1次，持续28 d；癫痫模型组和正常对照组同时经灌胃给予同体积生理盐水。停药1周，再用相同剂量的PTZ测试。

2.2观察大鼠的行为变化 大鼠癫痫发作评分标准[5],0级:行为上没有发作反应；Ⅰ级:节律性点头或头面部抽动；Ⅱ级:点头甩尾或阵挛性咀嚼；Ⅲ级:头部颤搐伴随前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级:袋鼠姿势和/或多肢抽动；Ⅴ级:全面性持续强直-阵挛性发作。每天对每只大鼠在PTZ注射后监测30-60 min，并记录癫痫发作的级别、发作潜伏期(s)(即注射PTZ到首次癫痫发作所需要的时间)及发作持续时间(s)，凡出现连续5 dⅡ级以上痫性发作的大鼠均为达到点燃模型标准。

2.3免疫组织化学检测 动物麻醉后断头处死，在低温条件下迅速取脑，甲醛固定用于免疫组化SABC法检测皮质和海马区N-cadherin及NT-4的免疫反应性；空白实验不用Ⅰ抗，以PBS代替，孵育切片。光镜下观察，胞质和核膜显示棕黄色颗粒者为N-cadherins免疫反应阳性细胞，胞核显示棕黄色颗粒者为NT-4免疫反应阳性细胞。Image-Pro Plus 6.0图像处理软件系统分析。

2.4Western blotting检测 低温取材海马组织，称重，匀浆。4℃条件裂解30min。4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清。测定样品蛋白含量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。4℃转膜1 h。TBST漂洗3次。平缓摇床，室温封闭孵育1 h。TBST漂洗3次。Ⅰ抗4℃孵育过夜。TBST漂洗3次。Ⅱ抗37℃平缓摇动孵育1 h。TBST漂洗2次，TBS漂洗1次。BCIP-NBT显色剂显色。GIS凝胶图像处理系统分析。

3统计学处理

结 果

1行为学观察

癫痫组和灵芝孢子粉组实验动物在实验过程中发现均有连续多次 Ⅱ- Ⅴ级惊厥发作，全部达到点燃标准。癫痫组实验动物在注射戊四氮后 2 - 6 min内即开始发作，最先出现睑肌阵挛、点头运动、尾巴翘起，严重者继之双前肢抬起阵挛,随后出现四肢抽搐，部分动物出现翻滚、跳跃 ，每次发作持续 1-30 min不等，常反复发作。灵芝孢子粉组初期动物发作与癫痫组相仿,但潜伏期较癫痫组稍长 3 min左右，实验后期，用药组发作时间明显缩短，发作级别降低，少有大发作。

2各组大鼠皮质和海马区N-cadherin含量免疫组化染色变化

测定实验大鼠皮质和海马区N-cadherin积分吸光度变化，实验结果表明，正常对照组：海马和皮质区均有少量N-cadherins分布，但分布不均衡，海马区表达高于皮质；癫痫模型组：与空白组比较，差异显著(Plt;0.01);灵芝孢子粉组：海马和皮质区N-cadherin蛋白表达明显下降，与模型对照组相比，差异显著(Plt;0.01)，见图1、表1。

Figure 1.Immunohistochemical staining (×200) of N-cadherin in brain hippocampus(A,B,C) and cortex (D,E,F).A,D：control group; B,E:PTZ group; C,F: PTZ+GLSP group.

表1 各组大鼠脑组织中N-cadherin积分吸光度变化

3脑组织NT-4含量变化

测定实验大鼠皮质和海马区NT-4积分吸光度变化，实验结果表明，癫痫模型组明显高于正常对照组，差异显著(Plt;0.01)，灵芝孢子粉治疗组高于癫痫模型组，差异显著(Plt;0.01)，见图2、表2。

4Westernblotting检测大鼠脑组织N-cadherin和NT-4蛋白含量的变化

Western blotting检测显示，癫痫后N-cadherin表达明显高于对照组，差异显著(Plt;0.01) ；用灵芝孢子粉干预后，N-cadherin的表达明显下降，差异显著(Plt;0.01)，见图3、4。癫痫后NT-4表达明显高于对照组，差异显著 (Plt;0.05) ；用灵芝孢子粉干预后，NT-4表达较癫痫组明显升高，差异显著(Plt;0.01)。

Figure 2.Immunohistochemical staining(×200) of NT-4 in brain cortex (A,B,C) and hippocampus(D,E,F).A,D:control group; B,E:PTZ group;C,F: PTZ+GLSP group.

表2 各组大鼠脑组织NT-4积分吸光度变化

讨 论

N-cadherin在神经元是有选择性的分布，正常时在海马和皮层表达相对较高而在纹状体表达较低。Fujita等[7]在海人藻酸(kainic acid,KA)诱导的惊厥模型中发现注射KA后12-24 h，N-cadherin mRNA的表达随着神经元的减少而减少，而在48 h至7 d，mRNA的表达部分恢复；而免疫组化染色显示KA注射后48 h，N-cadherin蛋白在存活神经元中的表达明显增高。我们的实验结果与其相符，PTZ点燃癫痫发作后N-cadherin的表达高于正常对照组，说明N-cadherin在癫痫后与海马内分子层苔藓纤维出芽和突触重塑有密切关系。

NT-4对神经元有促进存活、生长和分化作用，对保护海马和皮质神经元抵抗兴奋毒素和代谢损伤起着重要作用，对此，Royo等[8]在大鼠外伤性脑损伤的治疗实验中获得证实，长期应用NT-4能抑制50％海马神经元的死亡。因此它对癫痫和创伤性脑损伤等有神经变性的常见疾病起着至关重要的作用。在本实验癫痫模型组中，戊四氮诱导大鼠癫痫后NT-4的表达高于正常对照组，我们认为NT-4在癫痫后对神经起到保护作用。

灵芝孢子粉具有提高免疫调节、清除自由基、增强机体耐缺氧能力等功能，并且对神经系统还具有镇静和保护作用，因此可能通过调节机体的免疫、神经和内分泌系统作用于受损伤的神经元、激活机体内在的抗损伤机制。国内外有关灵芝孢子抗癫痫作用机制实验研究报道甚少,本科室已做了相关这方面的研究并取得了良好效果[9,10]。本实验中灵芝孢子粉干预组的实验动物癫痫发作级别和时间较癫痫模型组均有所下降,说明灵芝孢子粉对癫痫有一定的治疗效果。实验结果显示，癫痫发作后应用灵芝孢子粉能抑制N-cadherin的升高，促进NT-4的表达。所以推测灵芝孢子粉对癫痫既有预防作用，又有治疗作用。其可以提高神经细胞的存活，确保脑内微环境持续稳态而起到良好的抗癫痫作用，同时又减缓因癫痫发作导致的神经元损伤，增强内源性神经保护机能,促进受损神经元恢复，从而发挥对脑的保护作用。但是灵芝孢子粉抑制N-cadherin增加、促进NT-4表达的具体机制尚需进一步的研究。由于灵芝孢子粉的成份非常复杂,而且是口服给药，因此继续深入探索灵芝孢子粉治疗癫痫的药效机制，完善其药用价值必将对临床和科研有重大意义和价值。

Figure 3.Expression of NT-4 and N-cadherin proteins in cortex (Western blotting).±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs PTZ group.Lane 1: PTZ+GLSP group;Lane 2: control group;Lane 3: PTZ group.

Figure 4.Expression of NT-4 and N-cadherin proteins in hippocampus (Western blotting).±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs PTZ group.Lane 1:PTZ+GLSP group;Lane 2: control group;Lane 3: PTZ group.

[1]林 华.海马苔藓纤维出芽及突触重组与癫痫发生的相关性研究[D]．西安：第四军医大学，2005．

[2]Schober A,Wolf N,Huber K,et al.TrkB and neurotrophin-4 are important for development and maintenance of sympathetic pregangtionic neurons innervating the adrenal medulla[J].J Neurosci,1998,18(18):7272-7284.

[3]张能荣,张秀云.灵芝孢子粉中维生素和多糖的分析[J].中国生化药物杂志,1997,18(1):37-38.

[4]Sharma AK,Reams RY,Jordan WH,et al.Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis,induced rodent models and lesions[J].Toxicol Pathol，2007，35(7):984-999.

[5]Erdtmann-Vourliotis M,Riechert U,Mayer P,et al.Pentyenetetrazole(PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampus of kindled rats in suppressed by concomitant treatment with naloxone[J].Brain Res,1998,792(2):299-308.

[6]Morgan JI,Cohen DR,Hempstead JL,et al.Mapping pattern of c-fos expression in the central nervous after seizure[J].Science,1987,237(4811):193-197.

[7]Fujita M,Aihara N,Yamamoto M,et al.Regulation of rat hippocampal neural cadherin in the kainic acid induced seizures[J].Neurosci Lett,2001,297(1):13-16.

[8]Royo NC，Conte V，Saatman KE，et al．Hippocampal vulnerability following traumatic brain injury：a potential role for neurotrophin-4/5 in pyramidal cell neuroprotection[J]．Eur J Neurosci，2006，23(5)：1089-1102．

[9]李 晶,于海波,康玉明,等.灵芝孢子粉对癫痫大鼠学习记忆、caspase - 3和 livin的影响[J].中国病理生理杂志,2009,25(2):386 - 388.

[10]赵 璐,王淑秋,王 喆.灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠脑组织GDNF与 NT - 3表达的影响[J].中国病理生理杂志,2010,26(4):812 - 815.

EffectsofGanodermalucidumsporepoweronexpressionofN-cadherinandneurotrophin-4inthebrainsofepilepticrats

WANG Fang-fang1,WANG Shu-qiu1,SHAO Shuai2,LIU Lei1,LIU Jun-xing1,MA Xiao-ru1,LIANG Yan-feng1,WANG Shu-xiang1,ZHANG Jian-hua1

(1DepartmentofPathophysiology,CollegeofBasicMedicine,2TheSecondAffiliatedHospital,3LaboratoryofPediatricNeurologyRehabilitation,JiamusiUniversity,Jiamusi154007,China.E-mail:wang_shuq@163.com)

AIM: To observe the effects ofGanodermalucidumspore powder (GLSP) on the content of N-cadherin and neurotrophin-4(NT-4) in the brains of rats with epilepsy induced by pentetrazole (PTZ).METHODSThirty male Wistar rats were divided into 3 groups: GLSP group,epilepsy model group and control group (with 10 rats in every group).The epilepsy igniting model was induced by intraperitoneal injection of PTZ in the rats.The rats were killed and the brains were quickly collected at low temperature.The content of N-cadherin and NT-4 in cerebral cortex and hippocampus was measured with immunohistochemical staining and Western blotting.RESULTSThe rats in GLSP group and epilepsy model group all reached the “igniting” standard.Compared with epilepsy model group,the latent period in GLSP group extended obviously,but the duration was not obviously changed.Compared with control group,the content of N-cadherin and NT-4 in cortex and hippocampus increased obviously in epileptic model group.The content of N-cadherin was lower and the content of NT-4 was higher in GLSP group than those in epileptic model group (Plt;0.01).CONCLUSIONGanodermalucidumspore powder attenuates the noxious injury by overexpression of N-cadherin and regulation of neuronal excitability in central nervous system in the rats,thus preventing the neural cells from the damages of epilepsy.Ganodermalucidumspore powder also increases the expression of NT-4 to relieve seizure.

Epilepsy; Pentetrazole; N-cadherins; Neurotrophin-4; Ganoderma lucidum spores

1000-4718(2011)05-1003-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.033

2010-10-13

2011-03-16

黑龙江省自然科学基金资助项目(No.D200803)；国家自然科学基金资助项目(No.81041116)

△通讯作者Tel：0454-8618518；E-mail：wang_shuq@163.com