营养性肥胖大鼠的脂代谢紊乱与下丘脑中增食欲素A的表达分析*

赵玉红， 吴丽霞， 关 心， 王 伟， 赵玉岩

(1沈阳医学院沈洲医院检验科，辽宁 沈阳 110002；2中国医科大学附属第一医院内分泌科，辽宁 沈阳 110001)

营养性肥胖大鼠的脂代谢紊乱与下丘脑中增食欲素A的表达分析*

赵玉红1△， 吴丽霞1， 关 心1， 王 伟1， 赵玉岩2

(1沈阳医学院沈洲医院检验科，辽宁 沈阳 110002；2中国医科大学附属第一医院内分泌科，辽宁 沈阳 110001)

目的： 研究营养性肥胖大鼠下丘脑中增食欲素(orexin A)表达与脂代谢紊乱的规律。方法高脂饮食诱导并评估营养性肥胖大鼠动物模型；采用化学发光免疫分析法和生化酶法测定大鼠血清胰岛素(Ins)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)；应用实时定量PCR检测下丘脑组织中orexin A mRNA的表达规律。结果大鼠高脂膳食饲养8周后，营养性肥胖大鼠的体重、体脂含量和Lee′s指数均高于对照组，血清Ins增加约50％，TG和TC分别增加约94％和43％(Plt;0.05)；营养性肥胖大鼠下丘脑中orexin A的mRNA表达减少约57 ％ (Plt;0.05),且orexin A的表达量与Lee′s指数、Ins、TG、TC呈显著负相关，相关系数分别为r=-0.798 (Plt;0.05)、r=-0.868(Plt;0.05)、r=-0.981(Plt;0.05)和r=-0.815(Plt;0.05)。结论在大鼠高脂膳食诱导的营养性肥胖过程中，下丘脑orexin A的低表达和脂代谢紊乱均与营养性肥胖的发生密切相关。

增食欲素A；肥胖症；脂代谢; 基因表达

肥胖是指进食热量多于身体消耗量,以脂肪形式储存于体内，目前已成为现代社会中最常见的营养障碍性疾病。肥胖是一种由食欲和能量调节紊乱引起的疾病,与基因、环境、膳食结构等多种因素有关,其发病原因与遗传、中枢神经异常、营养、内分泌功能紊乱等因素密切相关[1]。增食欲素A(orexin A)是由下丘脑组织中合成并分泌的一种神经肽，通过其受体调节摄食、应激等多种生理过程，在肥胖和糖尿病发生中起重要作用[2]。但orexin A在肥胖病理状态中的调控效应尚不清楚。本研究探讨orexin A在营养性肥胖大鼠下丘脑组织中的表达与脂代谢的变化规律，以期阐明orexin 系统与机体脂类代谢紊乱的相关性和意义。

材 料 和 方 法

1营养性肥胖大鼠动物模型的建立与评价

2血糖和脂代谢检测

应用微型血糖仪测定全血葡萄糖(blood glucose，BG)；采用化学发光免疫分析法(DPC)检测大鼠血清胰岛素(insulin，Ins)水平；采用生化酶法(Roche)大鼠血清甘油三酯(triglyceride，TG)和总胆固醇(total cholesterol，TG)。

3实时定量PCR分析下丘脑组织orexinAmRNA表达

大鼠喂养8周后，无菌条件下快速解剖其脑组织，将下丘脑定位区域(前边界为乳头体，后边界为视交叉，深约2 mm)分离取出，按Total RNA Isolation System(Gibco)说明分离提取下丘脑总RNA。PCR反应引物序列如下: orexin A上游引物5’-CGG ATT GCC TCT CCC TGA GC-3’，下游引物5’-GCA ACC GCC ACC GCT TTA G-3’； β-actin上游引物5’-AGA GCT ACG AGC TGC CTG AC-3’，下游引物5’- AGT ACT TGC GCT CAG GAG GA -3’。应用Light-cycler real-time PCR仪(Roche)和Syber-Green RNA扩增试剂盒(Roche)，采用一步法进行RT-PCR反应，反应方案依据试剂盒操作步骤。反应条件为：逆转录55 ℃ 10 min,变性95 ℃ 40 s,循环条件为：95 ℃ 0 s，57 ℃ 10 s,72 ℃ 18 s，45个循环。熔解曲线分析条件为：95 ℃ 0 s，65 ℃ 10 s，95 ℃ 0 s，冷却40 ℃ 30 s。分析时用pSV2- orexin作标准曲线，以β-actin为内参照。每个样品做5次检测，计算目的基因和β-actin的比值。

4统计学处理

结 果

1高脂膳食诱导大鼠脂代谢紊乱

高脂膳食喂养8周后，大鼠的体重、体脂含量和Lee′s指数均高于正常对照组，见表1；血清Ins增加约50％，TG和TC分别增加约94％和43％，见表2，差异显著(Plt;0.05)。

表1 高脂膳食诱导营养性肥胖大鼠的脂代谢异常

2营养性肥胖大鼠下丘脑orexinA的表达及其相关性

高脂膳食喂养8周后，营养性肥胖大鼠下丘脑orexin A的mRNA的表达量比正常对照组减少57％ ，见表2，差异显著(Plt;0.05)。统计学分析显示，营养性肥胖大鼠orexin A的表达量与Lee′s指数、Ins、TG、TC呈显著负相关，相关系数分别为r=-0.798 (Plt;0.05)、r=-0.868 (Plt;0.05)、r=-0.981(Plt;0.05)和r=-0.815 (Plt;0.05)；而orexin A的表达量与大鼠血糖及体脂含量无明显相关性。

表2 高脂膳食诱导营养性肥胖大鼠的脂代谢与orexin A表达

讨 论

肥胖是一种由食欲和能量调节紊乱引起的疾病，其发病原因与遗传、中枢神经异常、营养、内分泌功能紊乱等因素密切相关。有研究显示，肥胖症中许多内分泌、神经、激素、细胞内等途径失调[4]。近年来发现很多生物因子与肥胖及肥胖的发病机制有关，如游离脂肪酸、甘油、激素、致炎因子等[5]。Orexin A表达于涉及摄食行为的侧下丘脑区域，参与能量代谢、心血管功能、激素平衡及睡眠/唤醒行为等多种生理或病理过程。Orexin A可以剂量依赖方式增加摄食[6]，是机体能量平衡调节网络中的重要物质。本研究发现，高脂膳食诱导的营养性肥胖大鼠体内下丘脑中orexin的基因表达明显增强，提示能量代谢异常可调节下丘脑功能，机体可能通过对orexin A基因表达的调节干预体内的脂类代谢。

Orexin A调控的因素还涉及其它内分泌和代谢的敏感因素。血清胰岛素及脂代谢的变化都可能参与了orexin A的调节。下丘脑侧部是摄食中枢，这个部位损伤可抑制进食，使体重下降，这表明该区域是调节进食和能量平衡的关键部位。对体质指数(BMI)为 19.8-59.0 的人进行血浆orexin A和瘦素测定，发现 orexin A水平与BMI成负相关，瘦素水平与BMI呈正相关[7]。单纯性肥胖及病态肥胖患者血浆orexin A水平明显低于正常对照组，这一步说明orexin参与机体能量代谢调节[8]。Beck等[9]报告orexin A的表达与血清TG呈负相关。而Wortley等人[10]研究发现，有肥胖倾向大鼠的orexin A神经元具有脂肪敏感性，对循环中的脂类产生应答，当机体处于高脂血症状态下，orexin A基因表达是增加的。这与本研究的结论相矛盾。我们认为，orexin A除中枢性增加摄食外，尚可通过外周对胰岛素的直接刺激作用导致脂肪同化，最终引起肥胖、胰岛素抵抗、脂代谢异常的发生和发展。脂代谢异常作为胰岛素抵抗的一个重要标志，脂代谢与orexin A的之间更深层次的作用机制有待深入研究。

[1]Steven EK,Rebecca LH,Kristina MU,et al.Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes[J].Nature,2006,444(14): 840-846.

[2]Voisin T,Rouet - Benzineb P,Reuter N,et al .Orexins and their receptors : structural aspects and role in peripheral tissues[J].Cell Mol Life Sci,2003,60(1): 72-87.

[3]Park ES,Yi SJ,Kim JS,et al.Changes in orexin-A and neuropeptide Y expression in the hypothalamus of the fasted and high-fat diet fed rats[J].J Vet Sci，2004,5(4): 295-302.

[4]赵玉岩,郭 磊,都 健,等.增食欲素系统在胰岛素抵抗大鼠胰腺组织中的表达及意义[J].中国病理生理杂志,2009,25 (1) : 160 - 162.

[5]Chandler PC,Viana JB,Oswald KD,et al.Feeding response to melanocortin agonist predicts preference for and obesity from a high- fat diet[J].Physiol Behav,2005,85(2): 221-230.

[6]Yi CX,Serlie MJ,Ackermans MT,et al.A major role for perifornical orexin neurons in the control of glucose metabolism in rats[J].Diabetes， 2009,58(9):1998-2005.

[7]Adam JA,Menheere PP,van Dielen FM,et al .Decreased plasma orexin-A levels in obese individuals[J].Int J Obes Relat Metab Disord,2002,26(2): 274-276.

[8]Knutson KL,Van Cauter E.Associations between sleep loss and increased risk of obesity and diabetes[J].Ann N Y Acad Sci,2008,1129: 287-304.

[9]Beck B,Richy S,Dimitrov T,et al.Opposite regulation of hypothalamic orexin and neuropeptide Y receptors and peptide expressions in obese Zucker rats[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,286(3): 518-523.

[10]Wortley KE,Chang GQ,Davydova Z,et al.Peptides that regulate food intake: orexin gene expression is increased during states of hypertriglyceridemia[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2003,284(6):R1454-R1465.

HypothalamicexpressionoforexinAandlipidmetabolismdisorderinratswithalimentaryobesity

ZHAO Yu-hong1,WU Li-xia1,GUAN Xin1,WANG Wei1,ZHAO Yu-yan2

(1DepartmentofLaboratoryMedicine,TheSecondAffiliatedHospitalofShenyangMedicalCollege,Shenyang110002,China;2DepartmentofEndocrinology,FirstClinicalHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail：G572@sina.com)

AIM: To evaluate the effect of orexin A in rat hypothalamus on lipid metabolism disorder in rats with alimentary obesity induced by high-fat diet.METHODSThe rat model of alimentary obesity was induced by high-fat diet.The levels of insulin,triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) in the serum were detected by luminescent immunoassay and enzymic method.The mRNA expression of orexin A in rat hypothalamus was determined by real-time PCR.RESULTSThere were statistically significant differences of weight,body fat content,and Lee′s index between high-fat diet group and control group after 8-week feeding of high-fat diet.Compared to control animals,the levels of insulin,TG and TC in the rats with alimentary obesity significantly increased by 50％,94％ and 43％,respectively (Plt;0.05).The expression of orexin A in rat hypothalamus significantly decreased by 57％,and had significant negative correlation with Lee′s index,insulin,TG and TC.Their correlation coefficients werer=-0.798 (Plt;0.05),r=-0.868 (Plt;0.05),r=-0.981(Plt;0.05) andr=-0.815 (Plt;0.05),respectively.CONCLUSIONAlimentary obesity and lipid metabolism disorder induced by high-fat diet are correlated with down-regulation of orexin A expression in rat hypothalamus.

Orexin A; Obesity; Lipid metabolism; Gene expression

1000-4718(2011)05-1000-03

R459.52

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.032

2010-05-31

2011-03-14

国家自然科学基金资助项目(No.30872724)；辽宁省自然科学基金资助项目(No.20082116)；辽宁省科技攻关层次计划资助项目(No.2008225009; No.2009225010-3)

△通讯作者 Tel：024-83282538;E-mail：G572@sina.com