α7烟碱样乙酰胆碱受体拮抗剂减轻淀粉样β蛋白诱导的PC12细胞损伤的机制研究*

汪志刚， 戚仁斌， 李 卫， 朱丽红， 沈文娟， 张 晶， 赵彦儒， 陆大祥△

(暨南大学1附属第一医院危重病医学科，3附属第一医院神经外科，2医学院病理生理学系，广东 广州 510632)

α7烟碱样乙酰胆碱受体拮抗剂减轻淀粉样β蛋白诱导的PC12细胞损伤的机制研究*

汪志刚1,2， 戚仁斌2， 李 卫3， 朱丽红2， 沈文娟2， 张 晶2， 赵彦儒2， 陆大祥2△

(暨南大学1附属第一医院危重病医学科，3附属第一医院神经外科，2医学院病理生理学系，广东 广州 510632)

目的： 探讨长时间应用α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7 nAchR)拮抗剂对淀粉样β蛋白(Aβ)处理的PC12细胞的影响及其作用机制。方法采用高分化的PC12细胞作为研究对象，用Aβ25-35复制细胞损伤模型；以α7 nAchR拮抗剂(甲基牛扁亭碱，methyllycaconitine)和nAchR激动剂(尼古丁，nicotine)预处理PC12细胞。实验分4组：空白对照组、Aβ25-35组、尼古丁+ Aβ25-35组和甲基牛扁亭碱+ Aβ25-35组。用JC-1荧光分子探针通过线粒体膜电位检测PC12细胞的凋亡，用Western blotting检测α7 nAChR和凋亡调节蛋白(Bcl-2/Bax)的表达。结果在药物作用36 h后，与空白对照组比较，Aβ25-35组的凋亡率增高，Bcl-2/Bax和Bax的表达无明显差异，α7 nAChR表达增加；与Aβ25-35组比较，尼古丁+ Aβ25-35组细胞凋亡率降低，但是Bcl-2/Bax表达也无明显差异，而α7 nAChR和Bax表达均降低；与Aβ25-35组比较，甲基牛扁亭碱+ Aβ25-35组凋亡率虽然无明显差异，但是Bcl-2/Bax表达显著升高，同时α7 nAChR和Bax表达均明显降低；与尼古丁+ Aβ25-35组比较，此时甲基牛扁亭碱+ Aβ25-35组的凋亡率较高，Bcl-2/Bax显著升高，α7 nAChR和Bax表达均显著降低；除空白对照组外，α7 nAChR和Bax表达呈明显正相关。在药物作用84 h后，与空白对照组比较，Aβ25-35组的凋亡率仍然是增高的，Bcl-2/Bax表达仍然无明显差异，α7 nAChR表达降低，Bax表达明显增高；与Aβ25-35组比较，尼古丁+ Aβ25-35组细胞凋亡率和Bcl-2/Bax表达无明显差异，α7 nAChR和Bax表达仍然较低；与Aβ25-35组比较，甲基牛扁亭碱+ Aβ25-35组凋亡率有所降低，而且Bcl-2/Bax表达仍然显著升高，α7 nAChR和Bax表达仍然明显降低；与尼古丁+ Aβ25-35组比较，甲基牛扁亭碱+ Aβ25-35组的凋亡率较低，Bcl-2/Bax仍然显著升高，α7nAChR和Bax表达仍然显著降低；除空白对照组外，α7 nAChR和Bax表达呈明显正相关。结论随着作用时间的延长，尼古丁的保护作用逐渐消失，而甲基牛扁亭碱的保护作用逐渐显现。甲基牛扁亭碱可能是通过下调α7 nAChR并阻断Aβ25-35的损伤作用，显著持续升高Bcl-2/Bax，从而可能产生抑制细胞凋亡的作用。所以，nAcR激动剂也许并不适合长时间治疗阿尔茨海默病，而拮抗剂可能会为治疗提供一个新的方向。

淀粉样β蛋白； PC12细胞； 烟碱拮抗剂； 烟碱激动剂； 细胞凋亡； 线粒体膜电位

α7型烟碱样乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAchR)在海马表达较为丰富[1,2]，与认知和记忆密切相关。阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)突出的临床症状是认知和记忆障碍，其重要病理特征是突触前神经元的丢失及其烟碱受体的减少，其中淀粉样β蛋白(Aβ)在疾病过程中具有关键作用。

目前的研究多倾向于认为nAchR激动剂对神经细胞具有保护作用[3,4]，而拮抗剂不但无保护作用，而且能够阻断激动剂的保护作用[3,5]。但是，现实情况是，包括治疗AD最常用的药物胆碱酯酶抑制剂(增加激动剂乙酰胆碱)，nAchR激动剂长期应用后其效果逐渐丧失[6-10]。而学界对nAchR拮抗剂的长期应用缺乏关注。同样作为受体，在治疗慢性心功能不全时，β受体激动剂短期应用具有改善症状，长期应用症状恶化，甚至增加死亡率；而β受体阻滞剂，短期内应用可能会加重症状，但是长期应用不但可以改善症状，而且降低死亡率。

在AD中，凋亡是神经元丢失的重要原因，Aβ蛋白可以引起神经细胞内钙离子失衡[11]，而钙离子超载与线粒体途径凋亡有密切关系。线粒体凋亡途径涉及到Bcl-2和Bax的表达，Bcl-2/Bax[12,13]是决定细胞存活或者凋亡的重要指标。

因此，本研究提出nAchR拮抗剂长时间应用可能具有神经细胞保护作用的工作假说，并从α7 nAChR和凋亡调节蛋白的改变探讨其可能机制。

材 料 和 方 法

1细胞培养

采用高分化的PC12细胞，购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。培养液为含10％胎牛血清的RPMI-1640，其中加入青霉素和链霉素(浓度均为1×105U/L)。于37 ℃、5％CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

2主要试剂和仪器

主要试剂：Aβ25-35和甲基牛扁亭碱(methyllycaconitine)购自Sigma，尼古丁(nicotine)购自日本和光纯药株式会社；培养基RPMI-1640购自ScienCell，胎牛血清购自Hyclone；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) 购自上海碧云天生物技术有限公司；Bax和Bcl-2抗体购自Cell Signaling Technology，α7 nAChR抗体购自Santa Cruz，Ⅱ抗兔抗鼠IgG和羊抗兔IgG 购自Southern Biotech,内参照抗体为HRP标记的GAPDH，购自上海康成生物公司。主要仪器：IX51荧光显微镜(Olympus)，Western blotting蛋白印迹电泳仪和Western blotting蛋白印迹电转仪(Bio-Rad)。

3方法

3.1药物和试剂制备 Aβ25-35母液浓度为1 000 μmol/L，使用前置于37 ℃培养箱孵育3-7d老化，作用浓度为10 μmol/L。尼古丁母液浓度2 000 μmol/L，作用浓度100 μmol/L；甲基牛扁亭碱母液浓度200 μmol/L，作用浓度10 μmol/L；二者加入到培养液中的体积相等。

3.2实验分组和药物处理 实验分4组：空白对照组、Aβ25-35组、尼古丁+Aβ25-35组和甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组。用24孔培养板接种PC12细胞，36 h实验细胞密度为2×104cells/well，84 h实验细胞密度为1×103cells/well。接种24 h后各组用蒸馏水或相应药物预处理，12 h后全部换液加入Aβ25-35和相应药物。分别于第1次加药后36 h和84 h进行相关检测。每24或36 h半量换液并补充Aβ25-35、蒸馏水或相应药物。

3.3JC-1荧光探针检测线粒体膜电位 (1)将JC-1原液稀释200倍，混匀后为JC-1 染色工作液。(2)将细胞进行相应处理后，加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混匀，置于细胞培养箱中37 ℃孵育20 min。(3)37 ℃孵育结束后，用JC-1 染色缓冲液洗涤2 次，加入2 mL细胞培养液，荧光显微镜下观察。检测JC-1 单体时把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm；检测JC-1 聚合物时，把激发光设置为525 nm，发射光设置为590 nm。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期；出现黄色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。(4)计算凋亡率：各实验组随机逐一选取5 个视野，拍照保存，计算每个视野照片的凋亡细胞所占细胞总数的比率，乘以100％，即为凋亡率。

3.4Western blotting检测Bcl-2/Bax和nAchR的表达 收集PC12细胞，抽提总蛋白，BCA 法测量蛋白浓度，上样，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，抗体孵育(Bax、Bcl-2和α7 nAChRⅠ抗稀释比例分别是1∶200、1∶200和1∶800)，采用化学发光法显色，用专用软件对蛋白条带灰度值进行分析。

4统计学处理

结 果

1通过线粒体膜电位检测药物作用36和84h后对PC12细胞凋亡的影响

图1、2和表1结果显示：药物作用细胞36和84 h后，Aβ25-35组的凋亡率明显高于空白对照组(Plt;0.01)，说明Aβ25-35损伤PC12细胞的模型是成功的。

Figure 1.Apoptosis of PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 36 h detected by fluor molecular probe JC-1 through mitochondrial membrane potential assay (the PC12 cells with yellow color are normal，and with green color are in pristine apoptosis,× 200 ) .A: blank control group;B: Aβ25-35 group ; C: Nicotine+ Aβ25-35 group; D: methyllycaconitine + Aβ25-35 group.

Figure 2.Apoptosis of PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 84 h detected by fluor molecular probe JC-1 through mitochondrial membrane potential assay (the PC12 cells with yellow color are normal，and with green color are in pristine apoptosis,× 200).A: blank control group; B: Aβ25-35 group ; C: nicotine+ Aβ25-35 group; D: methyllycaconitine + Aβ25-35 group.

表1 甲基牛扁亭碱或尼古丁+ Aβ25-35作用36和84 h后各组PC12细胞凋亡的比较

在36 h，尼古丁+ Aβ25-35组的凋亡率低于Aβ25-35组(Plt;0.01)，说明尼古丁在短期内应用可抑制Aβ蛋白引起的细胞凋亡，具有细胞保护作用；甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组和Aβ25-35组的差异无统计学意义，说明甲基牛扁亭碱短期内应用未表现出细胞保护作用；尼古丁+ Aβ25-35组的凋亡率低于甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组(Plt;0.05)，说明在短期内尼古丁对细胞的保护作用是优于甲基牛扁亭碱的。在84 h，尼古丁+ Aβ25-35组的凋亡率与Aβ25-35组的差异无统计学意义，说明随着药物作用时间的延长，尼古丁对细胞的保护作用已经丧失；甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的凋亡率虽然低于Aβ25-35，但是差异无统计学意义；但是，此时甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的凋亡率明显低于尼古丁+ Aβ25-35组(Plt;0.01)，说明此时甲基牛扁亭碱对细胞的保护作用可能优于尼古丁。

2药物作用36和84h对PC12细胞Bcl-2和Bax表达的影响

2.1甲基牛扁亭碱或尼古丁+Aβ25-35作用36 h后，对PC12细胞Bcl-2和Bax表达的影响 在36 h，Aβ25-35组Bcl-2/Bax的表达与空白对照组的差异并无统计学意义，其原因还不明确。尼古丁+ Aβ25-35组Bcl-2/Bax的表达与Aβ25-35组的差异也无统计学意义，说明尼古丁此阶段在基因表达水平对PC12细胞的凋亡无抑制作用。甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组Bcl-2/Bax的表达明显高于各组，说明甲基牛扁亭碱已经在基因表达水平具有抑制细胞凋亡的作用,见图3。

2.2甲基牛扁亭碱或尼古丁+ Aβ25-35作用84 h后，对PC12细胞Bcl-2和Bax表达的影响 在84 h，情况仍然与36 h类似，见图4。尼古丁在基因表达水平对PC12细胞的凋亡仍然无抑制作用，而甲基牛扁亭碱持续在基因表达水平具有抑制凋亡的作用。

Figure 3.Bcl-2/Bax ratio in PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 36 h.±s.n=3.**Plt;0.01 vs other groups.1：blank control group; 2：Aβ25-35 group; 3：nicotine+ Aβ25-35 group; 4：Methyllycaconitine +Aβ25-35 group.

Figure 4.Bcl-2/Bax ratio in PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 84 h .±s.n=3.**Plt;0.01 vs other groups.1：blank control group; 2：Aβ25-35 group; 3：nicotine+ Aβ25-35 group; 4：mMethyllycaconitine +Aβ25-35 group.

Figure 5.The protein expression of α7 nAChR and Bax in PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 36 h±s.n=3.**Plt;0.01 vs other groups; ##Plt;0.01 vs Aβ25-35 group; △△ Plt;0.01 vs blank control group.1：blank control group; 2：Aβ25-35 group; 3：nicotine+ Aβ25-35 group; 4：Methyllycaconitine +Aβ25-35 group.

3α7nAChR蛋白表达及其与Bax的关系

3.136 h α7烟碱受体表达及其与Bax的相关性分析 在36 h，Aβ25-35组的α7 nAChR蛋白表达高于空白对照组(Plt;0.01)，说明Aβ促进了PC12细胞α7 nAChR的表达；而Bax与空白对照组差异无统计学意义，原因尚不明确。尼古丁+ Aβ25-35组的α7 nAChR和Bax蛋白表达均低于Aβ25-35组(Plt;0.01)，说明尼古丁引起α7 nAChR和Bax的下调。甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的α7 nAChR和Bax蛋白表达均低于其它各组(Plt;0.01)，说明甲基牛扁亭碱引起α7 nAChR和Bax的下调较尼古丁更加明显，见图5。

同时，除空白对照组外，各组的Bax与α7 nAChR的表达具有一致性，故对其进行相关性分析。在Aβ25-35存在的条件下，药物作用36 h后，Aβ25-35组、尼古丁+ Aβ25-35组和甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的Bax和α7 nAChR呈显著正相关(r=0.862，Plt;0.01)。

Figure 6.The protein expression of α7 nAChR and Bax in PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 84 h±s.n=3.**Plt;0.01 vs other groups; ##Plt;0.01 vs Aβ25-35 group;△△ Plt;0.01 vs blank control group.1：blank control group; 2：Aβ25-35 group; 3：nicotine+ Aβ25-35 group; 4：methyllycaconitine +Aβ25-35 group.

3.284 h α7烟碱受体表达及其与Bax的相关性分析 在84 h，Aβ25-35组的α7 nAChR蛋白表达低于空白对照组(Plt;0.01)，说明Aβ最终导致了α7 nAChR的损伤和减少；而Bax明显高于空白对照组，说明Aβ25-35在基因表达水平诱导凋亡的发生。尼古丁+ Aβ25-35组的α7 nAChR和Bax蛋白表达均低于Aβ25-35组(Plt;0.01)，说明尼古丁在此阶段仍然可以引起α7 nAChR和Bax的下调。甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的α7 nAChR和Bax蛋白表达仍然均低于其它各组(Plt;0.01)，说明甲基牛扁亭碱引起α7 nAChR和Bax的下调，并且最为显著，见图6。

同样，除空白对照组外，各组的Bax与α7 nAChR的表达具有一致性，对其进行相关性分析。在Aβ25-35存在的条件下，药物作用84 h后，Aβ25-35组、尼古丁+ Aβ25-35组和甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的Bax和α7 nAChR显著正相关(r=0.980，Plt;0.01)。

结合相关和回归分析，发现在Aβ25-35存在的基础上，α7 nAchR和Bax密切相关，提示α7 nAchR可能介导了Aβ25-35对PC12细胞的损伤作用。

讨 论

Aβ蛋白可以诱导神经细胞凋亡，在AD的发生发展中起到重要作用[14]。实验发现Aβ25-35持续作用引起PC12细胞的凋亡，为实验成功复制了Aβ蛋白的损伤模型。相对于对照组，Aβ25-35组Bcl-2/Bax的表达与其无明显差异，机制尚不明确。可能的原因是，对照组无损伤因素，故其Bcl-2和Bax均在低水平表达，而Aβ蛋白损伤引起Bax增高的同时，也引起Bcl-2反应性升高[15]。也有可能是检测时点的问题，如在Aβ25-35刺激后12 h左右Bcl-2/Bax是否会有所下降，尚需进一步验证。Aβ25-35组的α7 nAChR在早期表达明显高于空白对照组组，有研究发现Aβ蛋白具有上调烟碱受体的作用[16]；但是在较长时间后，其α7 nAChR表达又明显低于对照组，这可能是Aβ蛋白最终导致烟碱受体的损伤和减少有关，这与AD的发病机制是一致的。

在实验早期(36 h)，尼古丁具有抑制细胞凋亡的作用[5]，体现了细胞保护作用。有人认为尼古丁通过激活蛋白质酪氨酸激酶(Janus kinase 2，JAK2)通路抑制神经细胞的凋亡[17]。甲基牛扁亭碱早期未表现出抑制细胞凋亡的作用，传统观点认为其无细胞保护作用，甚至阻断激动剂的保护作用[5]。随着尼古丁作用时间的延长(84 h)，尼古丁的保护作用逐渐丧失。有人发现，较长时间的尼古丁作用可以引起神经元的凋亡[6]，但是也有相反的观点[4,18]。在本研究中，随着时间的延长，甲基牛扁亭碱的保护作用逐渐显现，其凋亡率明显低于尼古丁组。有人认为Aβ蛋白早期(6-9 d)仅仅影响神经元突起的生长，用α7受体激动剂和拮抗剂预处理大鼠神经元，发现均可以抑制Aβ的毒性作用[19]。还有人发现，α4β2烟碱受体拮抗剂刺桐定和α7烟碱受体拮抗剂甲基牛扁亭碱作用大鼠神经元2 d，均具有保护作用[20]。但是关于拮抗剂的研究较少，其保护作用并不是非常明确。

诱导凋亡是通过改变凋亡调节蛋白起作用的。本实验结果显示，无论在短时间或者长时间内，尼古丁均未升高Bcl-2/Bax的表达；虽然其在早期具有抑制凋亡和神经保护作用，但是其内在的改变，即Bcl-2/Bax的表达已经不具有抑制凋亡的趋势，而其早期抑制凋亡的作用是否是通过其它凋亡调节通路尚不清楚。而甲基牛扁亭碱的Bcl-2/Bax表达一直保持在高水平，其重要原因是Bax表达一直维持很低的水平；虽然其早期并未表现出细胞保护作用，但是其内在的改变，即Bcl-2/Bax的表达已经具有抑制凋亡的趋势，为其最终产生细胞保护作用提供了潜在条件。

尼古丁+ Aβ25-35组和甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的α7 nAChR和Bax均明显低于Aβ25-35组，而以后者更为明显。尽管有研究认为激动剂具有上调烟碱受体的作用[21]，而对于拮抗剂多认为无上调受体的作用[22]，但是对不同受体其作用并不一致，如有研究发现激动剂和拮抗剂都可以上调α4β2 nAChR及其mRNA的表达，但是对α7 nAChR及其mRNA无影响[23]。在受体下调的同时，尼古丁+ Aβ25-35组和甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的Bax表达也明显比Aβ25-35组低，提示二者均有减轻Aβ损伤作用，但是甲基牛扁亭碱的作用更为突出。

Bax是促进细胞凋亡的凋亡调节蛋白，其表达与损伤性因素是一致的；在本实验中损伤因素是Aβ25-35，故二者应该存在因果关系。Aβ蛋白与α7 nAChR具有高度亲和力[24]，但Aβ蛋白是否通过α7 nAChR损伤神经细胞还不清楚。实验发现，除外空白对照组(无Aβ蛋白的损伤作用)，Aβ25-35组、尼古丁+ Aβ25-35组和甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组的Bax和α7 nAChR表达均依次降低， Bax和α7 nAChR表达呈现高度正相关，提示Aβ蛋白可能是通过α7 nAChR介导对PC12细胞的损伤。甲基牛扁亭碱可能通过下调α7 nAChR的表达，并阻断Aβ25-35与受体结合，从2个方面减轻Aβ蛋白的损伤作用。而尼古丁也下调α7 nAChR，故这也可能是其抑制Aβ损伤作用的一个原因。

综上所述，Aβ蛋白通过与α7 nAChR结合，促进钙离子内流，引起PC12细胞Bax表达增高，导致Bcl-2/Bax失衡，从而诱导细胞的凋亡；甲基牛扁亭碱通过下调α7 nAChR和阻断Aβ蛋白与受体结合，阻止了Bax的上升，使Bcl-2/Bax明显升高，为最终抑制细胞的凋亡提供了可能性；尼古丁也通过下调α7nAChR减少了Bax的上升，但是远不如甲基牛扁亭碱明显，故其未明显升高Bcl-2/Bax，可能是其对凋亡抑制作用逐渐丧失的原因。

因此，长期使用烟碱受体激动剂其细胞保护作用可能逐渐消失，而长期应用α7烟碱受体拮抗剂可能具有抑制神经细胞凋亡和细胞保护作用，可能为AD的治疗研究提供新的思路。

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Antagonistofα7nAChRrelievesinjuryofPC12cellsinducedbyamyloidβ-protein

WANG Zhi-gang1,2,QI Ren-bin2,LI Wei3,ZHU Li-hong2,SHEN Wen-juan2,ZHANG Jing2,ZHAO Yan-ru2,LU Da-xiang2

(1DepartmentofCriticalCareMedicine,3DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:ldx@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of long-term exposure to α7 nicotinic acetylcholine receptor(α7 nAChR) antagonist on PC12 cell injury induced by amyloid β-protein(Aβ).METHODSThe well-differentiated PC12 cells were used in the study.The injury model of PC12 cells was established by treating the cells with Aβ25-35.The interventions of nicotine and methyllycaconitine were carried out.The cells were divided into blank control group,Aβ25-35group,nicotine+Aβ25-35group and methyllycaconitine +Aβ25-35group.The apoptosis of PC12 cells was detected by fluor molecular probe JC-1 through mitochondrial membrane potential assay,and the levels of Bcl-2/Bax and α7 nAChR were detected by Western blotting.RESULTSAfter treated with the related reagents for 36 h,the apoptotic rate of PC12 cells and the expression of α7 nAChR in Aβ25-35group were higher than those in blank control group.No difference of Bcl-2/Bax and Bax between the two groups was observed.Compared with Aβ25-35group,the apoptotic rate and expression of α7 nAChR and Bax in nicotine+Aβ25-35group were decreased,and no difference of Bcl-2/Bax between the two groups was detected.Compared with Aβ25-35group,the apoptotic rate in methyllycaconitine+Aβ25-35group was unchanged; however,Bcl-2/Bax was obviously increased,and the expression of α7 nAChR and Bax was decreased.The apoptotic rate of PC12 cells in methyllycaconitine+Aβ25-35group was higher than that in nicotine+Aβ25-35group.The levels of Bcl-2/Bax,α7 nAChR and Bax in methyllycaconitine +Aβ25-35group were lower than those in nicotine+Aβ25-35group.Except blank control group,there was positive correlation between α7 nAChR and Bax.After treated with the related reagents for 84 h,the apoptotic rate and the expression of Bax in Aβ25-35group were higher,and the expression of α7 nAChR was lower in Aβ25-35group than those in blank control group.Compared with Aβ25-35group,the apoptotic rate and Bcl-2/Bax in nicotine+Aβ25-35group was unchanged,and the expression of α7 nAChR and Bax was decreased.The apoptotic rate in methyllycaconitine+Aβ25-35group was unchanged;however,Bcl-2/Bax was increased persistently,and α7 nAChR and Bax remained decreasing.Compared with nicotine+Aβ25-35group,the apoptotic rate,α7 nAChR and Bax in methyllycaconitine+Aβ25-35group were decreased,and there was also an obvious decrease in Bcl-2/Bax.CONCLUSIONThe protective effect of nicotine disappears with the time of exposure.However,methyllycaconitine shows a tendency of the protective effect.Methyllycaconitine probably suppresses apoptosis of PC12 cells by increasing Bcl-2/Bax through down-regulation of α7 nAChR and blocking the injury induced by Aβ25-35.Consequently,nicotinic agonist may not be suitable for the chronic treatment of Alzheimer disease,and nicotinic antagonist may provide a new direction.

Amyloid beta-protein; PC12 cells; Nicotinic antagonist; Nicotinic agonist; Apoptosis; Mitochondrial membrane potential

1000-4718(2011)05-0916-07

R34

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.016

2011-04-01

2011-05-03

广东省自然科学基金资助项目(No.845106320100363)；暨南大学科研培育与创新基金前瞻性与基础研究资助项目(中央高校基本科研业务费专项资金资助，No.21609425)

△通讯作者 Tel:020-85220004；E-mail: ldx@jnu.edu.cn