白细胞介素-27对白血病细胞株U937细胞生物学行为的影响

郭小燕， 翟凤范蕊芳， 林东军△

(中山大学 1附属第三医院血液科，2血液病研究所，广东 广州 510630)

白细胞介素-27对白血病细胞株U937细胞生物学行为的影响

(中山大学1附属第三医院血液科，2血液病研究所，广东 广州 510630)

目的： 探讨白细胞介素-27(IL-27)对人单核细胞白血病细胞株U937细胞的影响及其机制。方法用不同剂量的重组人IL-27和U937细胞分别共培养24 h和48 h，用荧光定量PCR测定细胞中促凋亡基因p53、bax及caspase-3、主要组织相容性复合物Ⅰ(MHCⅠ)类分子、协同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表达，流式细胞仪检测U937细胞表面CD86和CD54的表达，并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定IL-27对细胞增殖的影响。结果PCR结果显示经过不同剂量IL-27刺激后，U937细胞中促凋亡基因p53和bax表达增加，同时，U937细胞中凋亡相关蛋白caspase-3的表达及活性也有相应增加；MTT结果显示，IL-27可以抑制U937细胞增殖并和抗肿瘤药物阿糖胞苷产生协同作用；IL-27可以诱导U937细胞中的MHCⅠ类分子(HLA-A,B,C)、表面的协同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表达增加。结论IL-27可以诱导U937细胞中促凋亡基因的表达，直接抑制细胞增殖,对细胞中MHCⅠ、CD86和CD54的表达有诱导作用。这可能是IL-27抗肿瘤作用的重要机制。

白细胞介素27; U937细胞; 白血病; 单核细胞

白细胞介素-27(interleukin-27，IL-27)是新发现的IL-12家族细胞因子， 由EBI3(EBV-induced gene 3)和P28表达产物组成的异二聚体，其受体也是由2个亚基IL-27Ra(又名WSX-1或T-CCR)和gp130构成，共同表达于很多免疫细胞，如：CD4+T/CD8+T、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞等[1]。IL-27在机体的免疫调节中起到重要作用，它可以影响T细胞的分化，诱导T细胞向Th1方向分化，促使Th1型细胞因子表达，同时抑制Th2和Th17分化，并协同IL-12刺激细胞产生IFN-γ。在Th1高度活化时，IL-27却可以限制Th1型应答的强度。由于IL-27具有促进Th1型反应和减轻炎症的双重作用，它可能是多种主要以Th1型反应为主的病理过程(如感染免疫、自身免疫病和抗肿瘤免疫)的关键性调节因子[1-4]，但是作为IL-12家族的成员，除了免疫调节作用之外，学者们更关注其抗肿瘤活性，2004年，Hisada等[5]首次证实了IL-27的抗肿瘤活性。他们将稳定表达IL-27的小鼠结肠癌细胞C26移植到小鼠体内，发现肿瘤生长大大受抑，主要由CD8+T细胞、IFN-γ和T-bet介导其抗肿瘤作用。Yuan等[6]在BM-NSCs(骨髓来源的神经干细胞样细胞)中导入单链IL-27 cDNA，再将其注入小鼠颅内GL-26 神经胶质瘤，有50％小鼠幸存，且幸存的小鼠对颅内再次注射同种瘤细胞株有了持久的免疫力，表明机体产生了对肿瘤细胞的免疫记忆。Salcedo等[7]进一步证实，IL-27可以显著增加CD8+T细胞的局部浸润能力和局部IFN-γ基因的表达，并可以显著上调肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子的表达，增加肿瘤细胞对机体的肿瘤特异性细胞素性T细胞(cytotoxic T-lymphocyte,CTL)的敏感性。但是大多数的实验都是局限在实体瘤模型中，Feng等[8]证实，IL-27可以诱导人单核细胞白血病细胞株THP-1细胞表面的MHC分子、协同刺激分子CD86、CD80和黏附分子CD54的表达，并能诱导THP-1细胞分泌IFN-γ。我们的前期实验(结果未发表)证实IL-27受体的2个亚基在急性单核细胞白血病患者细胞中高表达，而且IL-27可以直接诱导人单核细胞白血病细胞株U937细胞的凋亡，并呈现出一种剂量依赖关系。本实验旨在探讨IL-27是否可以诱导U937细胞MHCⅠ类分子、黏附分子CD54及协同刺激分子CD86的表达，是否诱导U937细胞促凋亡基因p53及bax的表达，并激活凋亡相关蛋白caspase-3，以及IL-27是否跟抗肿瘤药物阿糖胞苷(arabinosylcytosine,Ara-C)发挥协同作用。

材 料 和 方 法

1材料

U937细胞株由上海细胞库提供；重组人IL-27、重组人IFN-γ(eBioscience)购于广州康润生物有限公司；PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa DRR037A)、SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa DRR041A)购于广州润真生物有限公司;CD86 PE和CD54 PE(eBioscience)购于广州康润生物有限公司;Taq酶(天根生化科技)购于广州合达生物科技有限公司；caspase-3活性试剂盒(碧云天生物科技)；MTT检测试剂盒(碧云天生物科技)；引物序列由广州英韦创津生物科技有限公司合成。

2方法

2.1细胞培养 U937细胞在10％小牛血清的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5％CO2的培养箱中培养，2-3 d传代1次。然后取对数生长期细胞进行实验。

2.2PCR及荧光定量PCR 测定MHCⅠ类分子(HLA-A,B,C)、p53、bax、caspase-3、CD86，CD54的表达 取对数生长期的细胞，以2×108cells/L接种至6孔板，加入不同浓度的IL-27(0、20、40、60 μg /L),共同培养24 h，48 h。Trizol法提取总RNA，并逆转录成cDNA，以紫外分光光度计测RNA的含量和纯度(RNA在260 nm和280 nm的吸光度比值为1.8-2.0之间)。以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性(28S和18S RNA条带比值gt;2.0)。应用Omiga 20软件设计MHCⅠ类分子(HLA-A,B,C)、p53、bax、caspase-3、CD86、CD54的引物序列。CD54正义链5’- TCACGGAGCTCCCAGTCCTAA -3’,反义链 5’-AAAGGCAGGTTGGCCAATGA-3’；CD86正义链 5’- TGGCCTAGGGTACAGGCAACA -3’,反义链 5’-GCCCAGATAGAAGTGGCTCCAG-3’；p53正义链 5’-AGAGCTGAATGAGGCCTTGGAA-3’,反义链 5’- GAGTCAGGCCCTTCTGTCTTGAAC -3’；bax正义链 5’-CATCATGGGCTGGACATTGG -3’,反义链 5’-CCACAAAGATGGTCACGGTCTG-3’；caspase-3正义链 5’- GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3’,反义链 5’-CTGAGGTTTGCTGCATCGACA-3’；HLA-A正义链 5’-GACGACACGCAGTTCGTGC-3’,反义链 5’- CATGTCCGCCGCGGTCCAA -3’；HLA-B正义链 5’- ACCAGAGCGAGGCCGGG -3’,反义链 5’- GTGTCCGCSCGGTCCAG-3’；HLA-C正义链 5’- CGCGCGGAGTCCRAGAGG-3’,反义链 5’-GTGTCCGCSCGGTCCAG-3’；β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)正义链 5’-CTCGCGC TACTCTCTCTTTCTGG-3’,反义链 5’- GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3’；GAPDH正义链5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,反义链 5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；按照TaKaRa试剂盒给定条件，用荧光定量PCR仪进行基因扩增。

2.3Caspase-3活性的测定 按照caspase-3活性试剂盒说明进行操作。首先制作对硝基苯胺(p-nitroaniline,pNA)标准曲线；然后收集培养了24 h的U937细胞后600 r/min 4 ℃ 离心5 min；弃上清，加入1mL PBS，900 r/min 4 ℃ 离心5 min;弃上清，加入200 μL裂解液，冰浴15 min;4 ℃ 23 500 r/min离心15 min;取上清120 μL于预冷离心管。在96孔板中加样，每孔加入Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroaniline)10 μL，待测样本10 μL，加检测缓冲液补足100 μL，每个样本设置3个复孔，并设置空白对照。37 ℃孵育4 h后,测在405 nm处的吸光值(A405)。Caspase-3活性表示为实验组与对照组的相对值，对照组caspase-3的活性默认为1。

2.4MTT检测细胞增殖 将100 mL 2×108cells/L细胞种入96孔板中，培养24 h，然后加不同的处理因素刺激细胞，空白组只加培养基，对照组不加处理因素，每组设5个复孔，继续培养。培养24 h后每孔加入10 μL MTT溶液，继续孵育4 h，然后每孔加入100 μL formazan溶解液，在细胞培养箱内继续孵育，直至在普通光学显微镜下发现formazan全部溶解，在570 nm测定吸光度。生长抑制率=(1-A实验组/A对照组)×100％。

2.5流式细胞术检测细胞表面CD86和CD54的表达 将2×108cells/L的细胞悬液100 mL接种于6孔板中，培养24 h，然后加入40 μg/L IL-27刺激细胞，以50 μg/L IFN-γ作为阳性对照，继续培养48 h后收集细胞，2 000 r/min离心10 min，加入2 mL PBS，洗涤2次，然后加入100 mL PBS重悬细胞，加入20 μL PE标记的抗CD86抗体或抗CD54抗体室温共同孵育30 min，加入PBS 2 mL，洗涤1次，加入200 mL PBS重悬细胞，用流式细胞仪测定。以上实验重复3次。

3统计学处理

结 果

1IL-27诱导U937细胞中促凋亡基因的表达增加

结果见图1：IL-27 可以诱导U937细胞中p53及bax mRNA的表达，呈现出剂量相关性，在IL-27浓度为40 μg/L时，IL-27的诱导作用最强。

Figure 1.Effect of IL-27 on expression of p53 and bax mRNA in U937 cells.The mRNA level of each sample were normalized to the level of GAPDH±s.n=9.*Plt;0.05 vs 0 μg/L group.

2IL-27对U937细胞中caspase-3表达的影响

IL-27可以明显增加U937细胞中caspase-3的活性(Plt;0.05)，并且与caspase-3 mRNA水平的增加表现出一致性,见图2。

Figure 2.Effect of IL-27 on caspase-3 mRNA expression(A) and caspase-3 activity(B) in U937 cells±s.n=3.*Plt;0.05 vs 0 μg/L group.

3IL-27对U937细胞的增殖抑制作用

将U937细胞分别和不同剂量的IL-27(0、20、40、60 μg/L)和Ara-C(5 g/L)共同孵育12 h、24 h、48 h,发现IL-27对U937细胞的增殖抑制作用随着时间的增加而增强，见图3A。然后将U937细胞分别与IL-27(40 μg/L),Ara-c(5 g/L)、IL-27(40 μg/L)+ Ara-c(5g/L)共同培养12 h、24 h、48 h，结果显示，IL-27可以直接抑制U937细胞增殖(以Ara-C作为阳性对照)，IL-27还能和Ara-C产生协同效应。

4IL-27诱导U937细胞MHCⅠ类分子、细胞表面的协同刺激分子和黏附分子表达增加

使用荧光定量PCR法检测U937细胞中MHCⅠ类分子以及协同刺激分子和黏附分子的表达(以IFN-γ作为阳性对照)。发现经过IL-27刺激之后，U937细胞中MHCⅠ类分子(HLA-A,B,C)及β2-MG表达增加,见图4A。在U937细胞中协同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表达呈现出相同趋势,见图4B。40 μg/L IL-27刺激48 h后，U937细胞表面(以IFN-γ作为阳性对照)CD86表达增加1.5倍，CD54表达增加 3倍,见图4。

Figure 3.The antiproliferative activity of IL-27 alone(A) and combined with arabinosylcytosine (Ara-C,B) on U937 cells.±s.n=9.*Plt;0.05 vs control(0 μg/L or 0 h).

Figure 4.IL-27 increased expression of classⅠMHC mRNA and constimulatory molecules in U937 cells.A and B:expression of class Ⅰ MHC and constimulatory molecule were evaluated by real-time PCR after 24 h of stimulation with various of amounts of IL-27(0,20,40 and 60 μg/L) and IFN-γ (0,5 and 50 μg/L).C:surface expression of CD86 and CD54,as detected by flow cytometry,is shown after 48 h of incubation with medium alone,40 μg/L IL-27 or 50 μg/L IFN-γ.IFN-γ was used as a positive control in A,B and C±s.n=3.*Plt;0.05 vs control(0).

讨 论

近年来肿瘤生物治疗(biotherapy)已成为肿瘤治疗的一种新趋势，主要通过调动宿主的天然防御机制或给予天然(或基因工程)产生的靶向性很强的药物来获得抗肿瘤效应,包括肿瘤的免疫治疗和基因治疗，其理想机制一是诱导肿瘤细胞自身生长的停滞或凋亡；二是诱导机体内具有抗肿瘤特异性和细胞毒性的 T淋巴细胞产生，达到特异性攻击肿瘤的作用，不仅能提高宿主免疫功能，特异性杀伤肿瘤细胞，而且对正常组织有较少的毒副作用，受到了人们的关注。由于血液肿瘤与免疫学关系密切，近年来免疫治疗显示出良好的应用前景。

细胞因子(cytokine)是由多种免疫细胞分泌的具有调节细胞生长分化、调节机体免疫功能、参与炎症反应等功能的小分子多肽的统称。在天然及获得性免疫应答过程中,细胞因子表现出重要功能，重组细胞因子已成为生物应答调节剂(biological response modifier,BRM)中一类重要的治疗制剂，目前IL-2及IL-11等细胞因子的基因工程产品已获准生产并用于疾病的治疗，一些细胞因子(如IL-2、IL-12、IFN、TNF)应用于抗肿瘤治疗，已取得了一定的效果。

在肿瘤免疫中，细胞因子起到重要作用，IL-12就是一个很重要的肿瘤免疫因子，它诱导Th1细胞、CTL及NK细胞产生IFN-γ进而发挥抗肿瘤作用[5]。IL-27作为一种新发现的IL-12家族细胞因子，其抗肿瘤作用也是学者们关注的焦点，IL-27的强大抗肿瘤作用已经在多种实体瘤的动物实验模型中得到证实，经过IL-27刺激的肿瘤细胞在实验动物中形成的肿瘤体积明显较小，并且接种过表达IL-27肿瘤细胞的实验动物，对再次接种肿瘤细胞产生了免疫耐受；在这些动物中，学者们发现CD8+T细胞的数量增加，并且在肿瘤周围集聚，IFN-γ的表达量也明显增加，因此有学者提出，IL-27的抗肿瘤作用主要是依赖于有特异性杀伤作用的CD8+T细胞(CTL)和体内其它细胞产生的IFN-γ；也有学者提出，在低抗原性的肿瘤模型中IL-27的抗肿瘤活性是通过NK细胞实现的[9]；另外，IL-27可以诱导抗血管生成细胞因子表达而抑制血管的生成，产生抗肿瘤作用[10]；IL-27还可以诱导肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子的表达，增加肿瘤细胞的抗原性及对特异性抗CTL的敏感性[9]。除此之外，IL-27对肿瘤细胞有直接增殖抑制作用也得到了证实。

本实验中，我们首次报道了IL-27可以诱导U937细胞中表达p53和bax mRNA表达增多，这种促凋亡基因的表达增加跟IL-27的剂量有关。这种凋亡基因的表达是否引起凋亡信号通路的激活呢？我们通过测定caspase-3 mRNA水平及其蛋白活性的改变来证实凋亡信号的激活。Caspase-3是细胞凋亡信号通路中的重要下游信号分子,其活性与细胞凋亡的发生有着极密切的关系[11,12]。我们发现经过IL-27刺激之后，caspase-3的活性有增加，并且和细胞的增殖抑制呈现一致性。我们推测IL-27诱导了的细胞中促凋亡基因的表达，启动凋亡信号，诱导凋亡相关蛋白caspase-3表达并活化，进而引起细胞凋亡。为了进一步证实IL-27的生物学作用，我们把IL-27和抗肿瘤药物Ara-C共同作用于U937细胞，测定细胞的增殖抑制率，发现IL-27除了可以直接抑制U937细胞的增殖，还可以和阿糖胞苷产生协同作用，这可能与IL-27诱导了U937细胞中的凋亡促进蛋白表达增加有关。

肿瘤细胞是一群失去正常调控机制发生恶变的自身细胞，机体自身的免疫机制可以对这种恶变细胞进行免疫防御。肿瘤特异性CTL对肿瘤的杀伤作用是机体肿瘤免疫的一个重要环节。CTL特异性杀伤肿瘤细胞，需要协同刺激分子CD86(CD80)和协同刺激分子CD54的辅助，来识别肿瘤细胞表面由MHCⅠ类分子提呈的肿瘤特异性抗原，但是由于肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子的表达较低，导致肿瘤细胞的抗原性低，不能被特异性识别，这是肿瘤免疫逃逸的一个重要机制[13]。在本实验中，我们测定了U937细胞表面的的协同刺激分子CD86和黏附分子CD54，以及细胞中MHCⅠ类分子的表达，发现CD86和CD54在基因水平和蛋白水平的表达都有增加，这与之前学者的研究一致[13]。这种细胞表面MHCⅠ类分子及黏附分子、协同刺激分子的表达增加，增加了CTL对肿瘤细胞的敏感性，从而发生依赖CTL的特异性肿瘤杀伤作用，达到抗肿瘤作用。但是我们发现，在IL-27浓度为40 μg/L时，其诱导细胞表达协同刺激分子和黏附分子的作用达到最大，在MHCⅠ类分子发现了同样的趋势，这与之前IL-27诱导协同刺激分子表达与剂量呈正相关不同[13]，可能跟IL-27复杂的生物学作用有关。

总之，我们的实验研究证明，IL-27有强大的抗肿瘤作用，它可以诱导U937细胞中促凋亡基因p53、bax表达增加,启动凋亡信号通路，诱导细胞中caspase-3表达，并活化caspase-3，直接诱导细胞凋亡。除了直接诱导U937细胞的凋亡，IL-27还可以跟抗肿瘤药Ara-C产生协同增殖抑制作用。另外，IL-27可以诱导U937细胞中的MHCⅠ类分子(HLA-A,B，C)、协同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表达增加。

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EffectsofIL-27onacutemonocyticleukemiccelllineU937

(1DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,2InstituteofHematology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lindongjun0168@163.com)

AIM: To investigate the effects of interleukin-27 (IL-27) on the U937 cell line of human acute monocytic leukemia and to explore the underlying mechanism.METHODSU937 cells were incubated with different concentrations of IL-27.Total RNA was isolated by Trizol.The expression levels of protein 53 (p53),Bcl-2 associated X protein (Bax),caspase-3,histocompatibility locus antigen-A (HLA-A),histocompatibility locus antigen-B (HLA-B),histocompatibility locus antigen-C (HLA-C),cluster of differentiation 86 (CD86) and cluster of differentiation 54 (CD54) were tested by real-time PCR.The expression of CD86 and CD54 on the cell surface was detected by flow cytometry.MTT method was used to determine the antiproliferative activity of IL-27.RESULTSThe results suggested that U937 cell growth was significantly inhibited by IL-27 in a dose-dependent manner.IL-27 induced the expression of pro-apoptotic genes,such asp53 andbax.The expression and activity of caspase-3 were also increased.IL-27 had antiproliferative activity and had an additive effect with arabinosylcytosine.After incubated with IL-27,high expression of class I major histocompatibility complex (MHC)，CD86 and CD54 in U937 cells were induced.CONCLUSIONIL-27 induces the expression of pro-apoptotic genesp53 andbax,which may play the antiprolifetative functions directly in U937 cells.IL-27 also induces the expression of class I MHC,CD86 and CD54,indicating an important antitumor role of IL-27.

Interleukin-27; U937cells; Leukemia; Monocytes

1000-4718(2011)05-0869-06

R557+2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.008

2010-03-10

2011-03-17

广东省科技计划资助项目(No.2009B080701008)

△通讯作者Tel：020-85252389;E-mail: lindongjun0168@163.com