复合溶剂选择性纯化紫杉醇的工艺研究

甘勇军，廖家荣，严明志，张倩，高宏伟，胡湘南

（1.重庆医科大学生命科学研究院，重庆市400016；2.四川遂宁市中医院药剂科，遂宁市 629000；3.重庆美联制药有限公司，重庆市 401122）

复合溶剂选择性纯化紫杉醇的工艺研究

甘勇军1＊，廖家荣2，严明志2，张倩2，高宏伟3，胡湘南1#

（1.重庆医科大学生命科学研究院，重庆市400016；2.四川遂宁市中医院药剂科，遂宁市 629000；3.重庆美联制药有限公司，重庆市 401122）

目的：研究复合溶剂选择性纯化紫杉醇的方法和工艺条件。方法：采用不同种类的溶剂在不同条件下对紫杉醇进行精制，以高效液相色谱法测定的紫杉醇粗品含量和主要杂质峰峰面积为指标，考察最佳的溶剂种类和工艺参数。结果：最佳工艺为纯化强极性杂质较高的紫杉醇，采用紫杉醇-丙酮-乙酸乙酯-正己烷（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）于－25℃冷冻24 h；纯化弱极性杂质较高的紫杉醇，采用紫杉醇-丙酮-三氯甲烷-正己烷（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）于－25℃冷冻24 h。结论：采用丙酮、正己烷分别与乙酸乙酯或三氯甲烷纯化紫杉醇，对于不同极性的杂质具有良好选择性，可用于紫杉醇的选择性纯化。

紫杉醇；复合溶剂；纯化

紫杉醇是从天然植物红豆杉属树皮中提取的一种抗癌新药，由于其结构新颖，作用机制独特，故紫杉醇的开发利用被誉为20世纪90年代抗肿瘤药三大成就之一[1]。紫杉醇是目前世界上最有效的新型抗微管药物，它的作用机制有别于其他抗微管药物[2]，其主要是通过刺激微管的聚合，促进微管双聚体装配成微管，使微管超稳定，最终使细胞增殖停止在有丝分裂期的G2/M期[3]。

文献报道，紫杉醇可采用一种或者两种溶剂纯化，比如采用甲醇纯化、甲醇与水纯化、丙酮与正己烷纯化等方法[4，5]。其中，甲醇纯化、甲醇与水纯化，对部分杂质无效，收率不高；丙酮与正己烷纯化收率高，对大部分杂质敏感，但是对于不同极性杂质选择性不好。本试验尝试在丙酮与正己烷溶剂体系中加入1种溶剂组成3种溶剂体系，以期达到高收率且选择性纯化紫杉醇。

1 仪器与试药

Aglent 1200型高效液相色谱（HPLC）仪（美国安捷伦科技公司）；Heiolph 4000型旋转蒸发仪（德国海道尔夫旋转蒸发仪厂）；GB1302电子天平（瑞士Mettler-Toledo有限公司）；ZF-20C暗箱式三用紫外分析仪（上海骥辉科学分析仪器有限公司）。

紫杉醇原料（重庆美联制药有限公司，含量：72.8%）；紫杉醇标准品（成都杰锐科技有限公司进口，含量≥98%，批号：SOC180）；甲醇为色谱纯，水为纯化水，甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 紫杉醇粗品的制备

取紫杉醇原料5份，各5.0 g，按表1中的溶剂种类与体积进行纯化，大量析出晶体后于－25℃冷冻12 h，抽滤，滤饼用二氯甲烷溶解，旋转蒸发器减压蒸干，得到紫杉醇粗品。

表1 精制紫杉醇的溶剂种类与体积Tab 1 Types and volume of solvent used for refining paclitaxel

2.2 紫杉醇的鉴别

2.2.1 色谱条件色谱柱：Symmetry Shield RPC18（150 mm×3.9 mm，4 μm）；流动相：甲醇-水（62∶38）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：227 nm；柱温：30℃；进样量：10 µL。

2.2.2 供试品和标准品溶液的制备 取“2.1”项下紫杉醇粗品和紫杉醇标准品各10 mg，加甲醇分别配制成浓度为0.4 mg·mL-1的供试品溶液和标准品溶液。

2.2.3 紫杉醇的鉴定方法 按上述色谱条件对紫杉醇粗品进行含量测定，HPLC图中，紫杉醇粗品溶液的主峰保留时间应与紫杉醇标准品溶液的主峰保留时间一致。

2.2.4 紫杉醇含量和杂质测定 按外标法以峰面积计算供试品中紫杉醇的含量；采用面积归一化法，计算保留时间在30 min前的杂质峰面积占总面积的百分比（简称纯度），选取紫杉醇粗品中7个主要杂质，比较纯化前、后杂质变化情况。在此条件下先出峰的杂质极性相对较强，后出峰的杂质极性相对较弱。

2.2.5 紫杉醇收率的测定方法 按“2.2.4”项下含量测定方法分别测定纯化前粗品含量和纯化后样品的含量，分别计算纯化前和纯化后的纯品量，纯化后的纯品量与纯化前紫杉醇纯品量的比值，即为紫杉醇收率。

3 结果

3.1 紫杉醇鉴定

取“2.2.2”项下供试品溶液和标准品溶液，按上述色谱条件进样测定。结果，供试品溶液的主峰保留时间与紫杉醇标准品溶液的主峰保留时间一致，表明供试品溶液中含有紫杉醇成分；保留时间30 min内，供试品溶液色谱中出现了7个主要的杂质峰，从左到右依次为杂质A、B、C、D、E、F、G。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.紫杉醇标准品；B.供试品Fig 1 HPLC chromatograms A.paclitaxel control；B.test samples

3.2 紫杉醇含量和收率的测定

按“2.2.4”、“2.2.5”项下方法测定紫杉醇粗品含量和收率。结果，试验3、4、5（丙酮、正己烷体系）所得粗品含量、收率优于试验1、2（甲醇体系）。紫杉醇粗品的含量和收率见图2。

图2 紫杉醇粗品的含量和收率Fig 2 The content and yield of paclitaxel crude products

3.3 紫杉醇杂质的测定

选取紫杉醇粗品中7个主要杂质，以纯度为指标，比较纯化前、后杂质降低情况。结果，试验1、2（甲醇体系）对部分杂质的纯化基本无效；试验3、4、5（丙酮、正己烷体系）对所有杂质的纯化均有效，并且杂质去除效果优于试验1、2（甲醇体系）；与试验3比较，试验4对极性较强的杂质更有效，试验5对极性较弱的杂质更有效。紫杉醇粗品纯化后杂质降低情况见图3。

图3 紫杉醇粗品精制后杂质降低情况Fig 3 The profiles of impurities reduction after refining taxol crude products

3.4 工艺优化

由“3.2”、“3.3”试验结果可知，试验3、4、5选择的纯化体系更好，故对这几个体系进行优化，以得到最佳的纯化工艺。

3.4.1 结晶溶剂比例优化 取紫杉醇原料4份，各5.0 g，按表2的溶剂种类与比例，照“2.1”项下方法制备紫杉醇粗品。并按“2.2.4”、“2.2.5”项下方法测定紫杉醇粗品含量和收率以及杂质变化情况（记为试验6、7、8、9）。结果，试验6、7、8、9所得粗品含量与试验4、5相近；试验6、7收率较高，试验8、9收率稍低；试验6、7相对于试验4，对极性较强的杂质更有效，试验7效果最好，即随着乙酸乙酯体积增加对极性较强的杂质更有效；试验8、9相对于试验5，对极性较弱的杂质更有效，试验9效果最好，即三氯甲烷体积增加对极性较弱的杂质更有效。综合以上情况，选择试验7、9进行纯化时间和温度的优化。紫杉醇粗品的含量和收率见图4；紫杉醇粗品纯化后杂质降低情况见图5。3.4.2 纯化温度的优化 重复表2中试验7、9，分别于5、－10、－25℃冷冻12 h后，抽滤，滤饼用二氯甲烷溶解，旋转蒸发器减压蒸干，得到紫杉醇粗品，并按“2.2.4”、“2.2.5”项下方法测定紫杉醇粗品含量和收率以及杂质变化情况。结果，温度变化后，试验7、9得到的粗品含量变化不大，低温条件下收率较高，在－25℃下收率最高；低温条件下某些杂质有所增多，但变化不明显。综合收率以及杂质情况，选择最佳的纯化温度为－25℃。紫杉醇粗品的含量和收率见图6；紫杉醇粗品纯化后杂质降低情况见图7。

表2 精制紫杉醇的溶剂种类与比例Tab 2 Types and volume of solvent used for refining paclitaxel

图4 紫杉醇粗品的含量和收率Fig 4 The content and yield of paclitaxel crude products

图5 紫杉醇粗品精制后杂质降低情况Fig 5 The profiles of impurities reduction after refining paclitaxel crude products

图6 紫杉醇粗品的含量和收率Fig 6 The content and yield of paclitaxel crude products

图7 紫杉醇粗品精制后杂质降低情况Fig 7 The profiles of impurities reduction after refining paclitaxel crude products

3.4.3 时间的优化 重复表2中试验7、9，分别于－25℃冷冻8、12、24 h后，抽滤，滤饼用二氯甲烷溶解，旋转蒸发器减压蒸干，得到紫杉醇粗品，并按“2.2.4”、“2.2.5”项下方法测定紫杉醇粗品含量和收率以及杂质变化情况。结果，冷冻时间变化后，试验7、9得到的粗品含量变化不大，长时间冷冻条件下收率较高，冷冻24 h收率最高；随着纯化时间的增加，杂质有所增加，因此选择最佳纯化时间为24 h。紫杉醇的含量和收率见图8；紫杉醇粗品纯化后杂质降低情况见图9。

4 讨论

在《美国药典》中，紫衫醇含量和有关物质测定是用甲醇、乙腈和水3项体系，梯度洗脱。笔者试验中采用过的色谱柱，以甲醇和水体系即能将所有的杂质分开；同时，测定紫杉醇的含量与杂质的方法与《美国药典》采用的方法基本相同，说明本方法适用于本品的含量和杂质测定。在此体系中，紫杉醇出峰时间在8.5 min左右，几乎所有的杂质均在30 min（紫杉醇主峰保留时间的3.5倍）内出峰，故文中讨论的均是30 min以前的色谱峰，且笔者采集5倍主峰保留时间，以便所有的杂质都能检测到。

图8 紫杉醇粗品的含量和收率Fig 8 The content and yield of paclitaxel crude products

图9 紫杉醇粗品精制后杂质降低情况Fig 9 The profiles of impurities reduction after refining paclitaxel crude products

按照反相色谱柱的一般规律，紫杉醇峰前的杂质一般认为比紫杉醇的极性大，紫杉醇峰后的杂质比紫杉醇极性小。因此，文中将紫杉醇杂质划分为极性强的杂质和极性弱的杂质。

复合溶剂纯化紫杉醇最佳工艺条件为对于强极性杂质较高的紫杉醇纯化，采用紫杉醇-丙酮-乙酸乙酯-正己烷（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）系统，于－25℃冷冻24 h；对于弱极性杂质较高的紫杉醇纯化，采用紫杉醇-丙酮-三氯甲烷-正己烷（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）系统，于－25℃冷冻24 h。此工艺析晶速度较快，溶剂易挥发，操作时应注意控制温度、搅拌速度、溶剂体积以及滴加速度。含量为72.8%的紫杉醇原料经丙酮-三氯甲烷-正己烷、丙酮-乙酸乙酯-正己烷、丙酮-正己烷纯化，得到紫杉醇成品，含量为99.6%，纯度为99.8%，最大单个杂质0.05%，熔点219～221℃。

[1] 张恩娟，张 昭，陈湘潘.紫杉醇的药代动力学研究概况[J].中国药房，1999，10（4）：187.

[2] 程玉龙，庄永志.紫杉醇联合卡铂治疗Ⅲb期和Ⅳ期非小细胞肺癌的临床观察[J].中国药房，2003，14（10）：612.

[3] 唐跃年，陈 颖，孙朝荣，等.紫杉醇静脉输注的注意事项[J].中国药房，2006，17（12）：946.

[4] 阎家麒.紫杉醇提取纯化工艺[J].中国医药杂志，1996，27（12）：531.

[5] 李春斌.东北红豆杉紫杉醇的提取纯化与HPLC检测[J].大连民族医学院学报，2005，7（5）：22.

Selective Purification Study of Paclitaxel with Complex Solvents

GAN Yong-jun，HU Xiang-nan（Institute of Life Sciences，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）
LIAO Jia-rong，YAN Ming-zhi，ZHANG Qian（Dept.of Pharmacy，Suining Municipal Hospital of TCM，Suining 629000，China）
GAO Hong-wei（Chongqing United Pharmaceuticals Co.，Ltd.，Chongqing 401122，China）

OBJECTIVE：To study the selective purification study of paclitaxel with complex solvents.METHODS：The paclitaxel was refined using different types of solvents under different conditions.The best solvent types and process parameters were obtained from HPLC detection of paclitaxel content and the main impurity peak area as index.RESULTS：The optimal technology was to purify strongly polar paclitaxel with high impurity，paclitaxel-acetone-ethyl acetate-n-hexane（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）were frozen at－25 ℃for 24 h；to purify weak polar paclitaxel with high impurity，paclitaxel-acetone-chloroform-n-hexane（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）were frozen at－25 ℃ for 24 h.CONCLUSION：The uses of acetone or n-hexane and ethyl acetate or chloroform were refined for different polar impurities with good selectivity，and it can be used for the selective purification of paclitaxel.

Paclitaxel；Complex solvents；Purify

R284.2；R943

A

1001-0408（2011）23-2145-03

＊助理研究员，硕士。研究方向：药物化学。电话：023-68485161。E-mail：cqjy0708@126.com

#通讯作者：副教授，硕士研究生导师。研究方向：药物化学。电话：023-66729212。E-mail：huxiangnan62@126.com

2011-03-10

2011-04-10）