南通地区犬细小病毒流行病学调查

沈永刚 （江苏省南通市动物卫生监督所 226008）



南通地区犬细小病毒流行病学调查

沈永刚 （江苏省南通市动物卫生监督所 226008）

本调查中，笔者对2008~2010具有临床症状的犬的粪便样品进行PCR分析，确定南通地区犬细小病毒流行类型。结果表明，CPV-2b为目前主要流行病毒株，CPV-2a的比例很低，没有CPV-2c和CPV-2型。

犬细小病毒 聚合酶链式反应 分子特征

犬细小病是犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的犬的一种以病程短、传染性强、死亡率高为特点的传染病。犬细小病毒最先于1978年在美国分离到，为了与先前众所周知的犬细小病毒区分开又将其命名为犬细小病毒II型(CPV-2)。CPV-2出现后就风靡全球，现在CPV-2流行于大多数家养犬和野生犬，该病对我国养犬业造成了极大的危害。通过单克隆抗体和限制性内切酶对细小病毒的分析，发现了一个新的抗原类型命名为CPV-2a，1979年左右CPV-2a在美国广泛蔓延并且在1980~1981年替代了原始病毒株。随后，大约在1984年另一种抗原变异体CPV-2b被发现，并且在1986年后美国大部分地区CPV-2b毒株又取代了CPV-2a毒株。现在CPV-2c又在意大利首次鉴定出来。尽管丹麦、德国、法国、西班牙、日本、澳大利亚、意大利和非洲分离株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c病毒株比例不同，通过对这些分离株抗原特异性分析显示：同一型的CPV-2病毒传播时，新的抗原类型的病毒株的出现陆续就取代了原有病毒株。在中国，犬细小病毒发生感染最早于1982年被发现，随后全国大范围内爆发高发病率与死亡率的犬出血性肠炎，然而到目前为止关于CPV流行的抗原类型信息很少。笔者根据3种抗原变异体的基因标记建立了多聚酶链式反应(PCR)方法来对犬细小病毒株进行分型，并且用这种方法对南通地区犬细小病毒开展流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 dNTP Mixture、Taq(5U/ml)、10×Buffer电泳缓冲液、DL2000 Markers和II限制性内切酶均购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖为基因公司产品。引物合成：上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 样品 样品来自2008~2010年间扬州大学动物医院经免疫胶体金试纸条检测为CPV强阳性的病犬粪便。取CPV阴性犬粪便作为阴性对照，CPV活疫苗作为阳性对照。

1.3 DNA的制备 样品用磷酸盐缓冲液(PBS，10%，w/v)稀释，然后8000r/min高速离心5min，取上清煮沸10min后冰浴。为了去除抑制聚合酶活性的残留物质，在PCR扩增前DNA样品用蒸馏水进行1:10稀释。

1.4 PCR引物设计 所有PCR引物设计根据GenBank中公布的CPV-2，2a，2b和2c的VP2衣壳基因序列(Accession No. AY380577, DQ340434，DQ025992，AB054223)设计而成。引物A(上游引物：5'-GGATGGGTGGAAATCACA GC-3'，下游引物：5'-ATAACCAACTCAGCTGGTC-3')分别位于VP2基因2954-2973 bp和3780-3799 bp处，用于扩增VP2上游序列，目的片段大小为815 bp。引物B (上游引物：5'-TCCAGAAGGAGATTGGATTC-3'，下游引物：5'-TTCTAGGTGCTAGTTGAGATT-3')分别位于4012-4031 bp和4509–4529 bp处，用来扩增VP2基因的下游序列，目的片段大小为518 bp，该扩增产物中包含一个II特异性酶切位点用于特异性的鉴定CPV-2c。

1.5 PCR反应 PCR反应参照文献并做微小改动，将反应中的MgCl2浓度调整为1.5mM。PCR反应程序为：94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环。PCR扩增产物1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色后凝胶成像系统拍照观察。

1.6 PCR产物限制性内切酶酶切反应 限制酶II能够选择性的识别CPV-2c VP2基因4060-4064 bp处GAAGA序列。通过引物B扩增获得的PCR产物取10μl根据说明用5单位II限制性内切酶，37℃酶切3h，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外凝胶成像系统拍照观察。

1.7 测序 将PCR扩增产物送至上海生物工程有限公司测序。

2 结果

2.1 PCR扩增结果 以阳性对照为PCR模板，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可以清晰地观察到两条与预期大小(815bp，518bp)相一致的目的条带。从临床健康犬粪便样品中未获得扩增条带，说明PCR反应体系正确，经PCR分析，239份粪便样品中，有230份经PCR扩增出现了2条特异性的目的条带。

2.2 限制片段长度多态性(RFLP)和测序结果 为了检测出样品中可能存在的CPV-2c型毒株，用II限制性内切酶进行RFLP分析，结果显示230份样品中没有CPV-2c型毒株。因此随机选取23(10%)份样品送去测序，结果显示23份样品为CPV-2a和CPV2b型(见表1)。

表1 23份阳性样品的来源与分型

23份样品测序显示仅仅2/23份的VP2蛋白在426位点处有AAT密码子，这是CPV-2a的特征，然而其余21份样品在VP2蛋白同一位点处为GAT密码子，是CPV-2b的特征(见表2)。

表2 23份样品PCR产物的序列分析氨基酸位点

3 讨论

就像1970年CPV-2的出现和突然消失令人惊讶一样，犬细小病毒发生了很多变化，例如病毒在短短的几年内宿主范围的迅速扩大。病毒的变异体如此之多部分是由于其突变速度就像RNA病毒的进化速度那么快所导致的，这些病毒对家养犬和野生物种的健康具有潜在的负面危害已经引起了人们广泛的关注。虽然犬细小病毒新的变异体CPV-2c第一次在意大利被检测出后就在其他欧洲国家和南美出现，但在本研究中笔者并没有发现CPV-2c，而且发现了CPV-2b出现的频率极高(21/23)，这也说明CPV-2b是目前南通地区犬细小病毒流行的主要毒株。尽管我国在1982年即发现了CPV，但在过去的几年里并没有关于CPV基因型的统计分析，无法分析CPV的进化过程。本调查结果指出在南通地区的CPV-2b突变体比CPV-2a突变体更流行，这与美国和英国的流行趋势相一致；而在德国和西班牙，CPV2a和CPV2b的发生几率相当；相比之下，澳大利亚则以CPV-2a的感染更为常见。对于CPV突变体在世界范围内分布不同的原因还不清楚。除了CPV-2b，笔者还鉴定了南通地区存在CPV-2a型的毒株，经序列分析，结果表明该毒株的基因型序列与已报道的nj01/06毒株序列果完全相同。由于南通和南京在地理位置上非常靠近，因此从这两个地方分离到基因型完全一致的毒株是完全有可能的。据知，目前在亚洲除了越南之外没有关于CPV-2c的报道。因此，更多的样品、更深入细致的调查亟待开展，只有这样，才能了解和掌握CPV在未来的流行和发展趋势。

（2011–07–06）

S858.292

A

1007-1733(2011)10-0060-02