HIF-1α、VEGF-C在贲门癌组织中的表达与临床意义

薛英杰 孟令新 王郡甫

HIF-1α是1种转录蛋白通过调节新陈代谢和诱导血管形成在肿瘤生长和转移方面起重要作用。HIF-1α在人类、动物几乎所有组织器官中均有表达。血管内皮细胞生长因子-C(VEGF-C)是1种重要的淋巴管生成因子，研究发现其在多种恶性肿瘤中呈高表达，与肿瘤的增殖和转移关系密切。关于HIF-1α、VEGF-C在贲门癌组织中的表达尚未见报道，我们旨在研究HIF-1α、VEGF-C在贲门癌中的表达及与临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集日照市人民医院病理科2002年6月～2009年6月间具有完整临床病理资料的贲门癌组织标本共60例。术后均经病理检查确诊，其中男性34例，女性26例，年龄36～74岁，平均(52.24±10.32)岁。肿瘤直径≥5 cm 35例，＜5 cm 25例;高分化20例，中分化35例，低分化5例;有淋巴结转移者39例，无淋巴结转移者21例;肿瘤浸润深度≥1/2肌层者38例，＜1/2肌层者22例。Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ期25例，Ⅳ期11例。患者术前均未作过任何放疗或化疗等治疗。正常贲门标本取自因食管、胃囊病变行贲门切除术的患者，共20例，男性11例，女性9例，年龄31～68岁，平均(46.67 ±9.63)岁。

1.2 染色方法

所有组织标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，制成4 μm厚连续切片，按说明书步骤行HE、免疫组化SABC染色。HIF-1α抗体稀释倍数为1∶100，PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。小鼠抗人 HIF-1α单克隆抗体、即用型兔抗人VEGF-C多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。着色强度按染色深度分:阴性(－)、弱阳性(+)、中度阳性(++)、强阳性(+++)。40×10倍视野下随机选5个视野，计数着色强度和着色百分比，利用公式计算着色指数，着色指数=阳性百分数×着色强度+1［1］，将其作为统计分析综合指标。

1.3 荧光定量RT-PCR

Trizol(Invitriogen公司)提取标本总RNA，引物序列由Oligo6.0软件设计、北京奥科生物技术有限责任公司合成。取2 μg总RNA用M-MLV逆转录酶(Promega公司)逆转录为cDNA。各种PCR引物及退火温度见表1，反应条件为95℃ 2 min;95℃ 30 sec;目的基因最佳退火温度30 sec;72℃ 1 min，35个循环;72℃ 5 min。PCR产物在含溴化乙锭2%的琼脂糖凝胶中电泳(电压5 V/cm)，用凝胶成像分析系统检测条带积分吸光度值。扩增曲线数据分析选择GeneAmp 5700 Sequence Detection System(Applied Biosystems，USA)中second derivative maximum(最大二阶导数)模式，基线调整选择算术模式得到Threshold cycle(Ct值)，即荧光信号检测系统在real-time Q-PCR整个扩增反应中进行实时检测和连续分析扩增相关荧光信号，得到相应Ct值。以目的基因与内参照(β-actin)积分吸光度比值衡量目的基因mRNA表达水平。因Ct值和起始拷贝数有着对应关系，同一标本中不同目的基因与βactin基 因 初 始 模 板 量 比 值 为 2-△Ct=2-［Ct(目的基因)－Ct(β-actin)］。△Ct=Ct(目的基因)－ Ct(β-actin)。比较同一基因在贲门癌和正常贲门组织中表达增加或减少倍 数 = 癌 组 织 ［2-Ct(目的基因)-Ct(β-actin)］/正 常 组 织［2-Ct(目的基因)-Ct(β-actin)］。

表1 RT-PCR反应中各基因的引物序列

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 HIF－1α、VEGF－C 在贲门组织中的表达

HIF－1α阳性物质主要定位于贲门癌细胞的胞核、胞质中，呈棕黄色颗粒状，间质细胞未见着色表达;在正常贲门黏膜细胞中只有基底层少数细胞呈弱阳性表达。而VEGF－C主要定位于癌细胞的胞质，在正常贲门黏膜组织中个别细胞表达或无表达。HIF－1α、VEGF－C在贲门癌组织中的表达明显高于正常贲门组织(均 P ＜0.05)，见表2。

表2 不同贲门黏膜组织中HIF-1α、VEGF-C的表达情况(s)

表2 不同贲门黏膜组织中HIF-1α、VEGF-C的表达情况(s)

注:▲为两组比较，P ＜0.01

VEGF-C正常贲门黏膜组别 例数 HIF-1α 20 1.000 ±0.000 1.000 ±0.000贲门癌 60 2.342±0.233▲ 2.051±0.538▲

2.2 HIF-1α、VEGF-C与贲门癌临床病理学特征关系

随着癌细胞分化程度降低和TNM分期增加，HIF-1α、VEGF-C表达水平增加，且高分化、中分化与低分化组相比均有显著性差异(P＜0.01)，Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期相比也有显著差异(P＜0.05);有淋巴结转移组HIF-1α、VEGF-C表达水平明显高于无淋巴结转移组(P＜0.01)，且靠近转移淋巴结的癌细胞HIF-1α、VEGF-C阳性程度高于远离淋巴结转移组织的癌细胞。随着浸润深度增加，HIF-1α、VEGF-C表达水平也逐渐增加，≥1/2肌层浸润组HIF-1α、VEGF-C表达水平比＜1/2组明显增加(P ＜0.01)。HIF-1α、VEGF-C 表达水平均与患者年龄、性别、肿瘤大小无关(P＞0.05)。见表3。

表3 HIF-1α、VEGF-C与贲门癌临床病理学特征的关系(s)

表3 HIF-1α、VEGF-C与贲门癌临床病理学特征的关系(s)

注:▲为 P ＜0.01，★为 P ＜0.05

VEGF-C年龄(岁)临床病理特征 例数 HIF-1α＜50 38 2.218 ±0.273 1.924 ±0.583≥50 22 2.525 ±0.231 2.243 ±0.677性别男34 2.286 ±0.225 2.002 ±0.482女26 2.481 ±0.217 2.258 ±0.547肿瘤大小(cm)＜5 25 2.304 ±0.188 1.985 ±0.731≥5 35 2.492 ±0.236 2.204 ±0.655组织学分级高分化 20 1.453 ±0.237 1.423 ±0.634中分化 35 2.392 ±0.563▲ 1.984 ±0.462★低分化 5 3.725 ±0.564▲ 2.712 ±0.745▲肌层浸润深度＜1/2 22 1.624 ±0.203 1.667 ±0.752≥1/2 38 3.541 ±0.548▲ 2.423 ±0.641▲淋巴结转移无39 1.382 ±0.563 1.698 ±0.326有21 3.628 ±0.612▲ 2.421 ±0.778▲TNM分期Ⅰ ～Ⅱ期 24 2.164 ±0.232 1.685 ±0.640Ⅲ ～Ⅳ期 36 3.236±0.683★ 2.231±0.723★

2.3 HIF-1α、VEGF-C在贲门癌组织中表达的相关性分析

随着贲门癌组织细胞分化程度的降低，HIF-1α、VEGF-C表达均呈递增趋势，经Spearman等级相关分析示HIF-1α与 VEGF-C呈正相关(γ=0.487，P＜0.01)。与无淋巴结转移组相比，有淋巴结转移组中HIF-1α与VEGF-C的表达明显增加，经Spearman等级相关分析示HIF-1α与VEGF-C呈正相关(γ=0.826，P＜0.01)。

2.4 荧光定量RT-PCR结果

RT-PCR反应完成后，HIF-1α、VEGF-C和 β-actin反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳确认目的扩增产物。电泳凝胶在Kodak440凝胶成像系统上成像，结果显示扩增产物单一、无杂带，为目的DNA片段，产物大小分别为:HIF-1α:168 bp，VEGF-C:142 bp，β-actin:305 bp。其中β-actin mRNA在不同组织中表达量大致相等，亮度大致相当，而癌组织中VEGF-C mRNA、HIF-1α mRNA条带较正常组织亮，说明VEGF-C mRNA、HIF-1α mRNA在癌组织中的表达较正常贲门组织中表达高。荧光定量RT-PCR反应完成后，得到HIF-1α、VEGF-C和内参β-actin RT-PCR反应过程的荧光-PCR循环数变化曲线。GeneAmp 5700 Sequence Detection System荧光－温度变化融解曲线分析结果表明，各管融解曲线为单峰，即RT-PCR产物为单一扩增产物。HIF-1α、VEGF-C mRNA在贲门癌组织中的表达明显高于正常组织，分别增加3.76和2.14倍。在Rn=0.01水平，荧光定量RT-PCR检测各目的基因与内参的结果及数据处理，见表4。

表4 贲门癌及正常组织细胞中各基因表达情况的比较

2.5 Real-time PCR产物基因测序结果

应用3700基因测序仪行PCR产物基因测序，应用NCBI Blast 2.2.16:Nucleotide sequence(BLAST Basic Local Alignment Search Tool)进行基因比对，发现HIF-1α序列与Genbank提供的定位于14q21-q24已知序列(BC043769)完全一致。VEGF-C基因序列与Genbank提供的定位于4q34.3已知序列(ID:7424)完全一致，说明检测结果是真实可靠的。

3 讨论

贲门癌发生在胃贲门部，是常见的胃肠道恶性肿瘤之一，具有独特的组织解剖学特性和临床表现，远处转移是贲门癌重要的生物学特征，也是难以彻底根治的主要因素，临床以淋巴结转移为主，且发生较早，死亡率约占总死亡率的12%。在决定贲门癌预后的众多因素中，淋巴结转移是其中重要的1个因素。

HIF-1是由HIF-1α和 HIF-1β 2个亚基组成的异源二聚体蛋白，其中HIF-1α主要控制HIF-1蛋白的稳定和转活。HIF-1α是1992年作为被低氧诱导的、连接在红细胞生成素基因缺氧反应元件上的转录因子而被发现的。在实质肿瘤生长所造成的低氧微环境中，HIF-1α通过调控一系列有关基因的表达来介导组织细胞对缺氧的适应反应，从而在维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管生成、促进增殖转移以及放化疗耐受等过程中起重要作用。HIF-lα作为缺氧条件下细胞应答最基本的调控因子，与肿瘤的发生、预后及治疗反应存在密切相关性［2］。HIF-1α在肿瘤中的过度表达与血管浓度、肿瘤浸润及预后相关。Griffiths等研究发现胃癌浸润边缘 HIF-1α的表达与淋巴结转移相关［3］。多因素分析显示HIF-1α是食管癌独立的预后因素，HIF-1α高表达者生存期较短，HIF-1表达与临床分期、淋巴结转移、DFS、总生存期密切相关［4，5］。本研究发现，60例贲门癌组织中存在不同程度的HIF-1α表达，其着色指数明显高于正常贲门组织，提示HIF-1α介导了贲门癌的发生发展。HIF-1α的表达与贲门癌患者的年龄、性别、肿瘤大小无相关性，而与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移、分化程度和肌层浸润深度密切相关，说明HIF-1α与贲门癌临床病理学特征关系密切，可能影响贲门癌患者的治疗和预后。这一结果与HIF-1α在其它实体癌中的表达类似［6］。

VEGF-C是VEGF家族的新成员，是最早发现的淋巴管生长因子，与淋巴管内皮细胞上VEGFR-3特异受体结合后，激活VEGFR-3引起SHc的磷酸化，促进淋巴管上皮细胞的转移;同时也可激活Ras/MAPK信号转导通路或TNK通路，诱导淋巴管内皮细胞肌动蛋白的重组，刺激淋巴管内皮细胞增殖［7］，诱导瘤周淋巴管生成，从而促进肿瘤的淋巴结转移。Wang等［8］运用免疫组化和RT-PCR法分析发现，VEGF-C的阳性表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移明显相关。Skobe等［9］通过转基因技术使人乳腺癌细胞株MDA2MB-435过表达VEGF-C，再将其植入免疫缺陷小鼠体内，发现瘤周的淋巴管高度增生、扩张，促进区域淋巴结转移。本研究证明，有淋巴结转移组VEGF-C的表达明显高于无淋巴结转移组，且靠近转移淋巴结的癌细胞VEGF-C阳性程度高于远离淋巴结转移组织的癌细胞，提示贲门癌中VEGF-C的表达与淋巴结转移相关。同时本研究还发现VEGF-C在随贲门癌浸润深度的增加阳性表达明显增加。这说明VEGF-C在贲门癌的浸润和淋巴结转移过程中起着重要的作用。

Tao等［10］发现 HIF-1α 阳性的胰腺癌中 VEGF-C的阳性表达率明显高于HIF-1α阴性的胰腺癌，HIF-1α的表达与VEGF-C的表达呈正相关。Katsuta等［11］研究发现在食管癌中HIF-1α、VEGF-C的高表达促进了淋巴结转移，且两者表达密切相关。本研究所得结论与上述研究一致，我们发现在贲门癌中HIF-1α、VEGFC的表达与淋巴结转移密切相关，两者的表达呈正相关(γ=0.826，P ＜0.05)。这提示 HIF-1α 与 VEGF-C在促进贲门癌淋巴结转移的过程中起协同作用，但具体机制有待深入研究。荧光定量RT-PCR及基因测序检测结果提示胰腺癌细胞在基因水平也高表达HIF-1α、VEGF-C，且分别与 Genbank中 的 已知 序 列BC043769、ID:7424完全一致，说明检测结果真实可靠。

总之，我们运用免疫组化、PCR、RT-PCR、基因测序等技术从蛋白表达、RNA转录、基因序列3个方面来证实贲门癌细胞中HIF-1α、VEGF-C的表达情况，进一步验证了HIF-1α、VEGF-C高表达与胰腺癌病情进展相关，并参与贲门癌的浸润和淋巴结的转移机制。HIF-1α、VEGF-C作为细胞表面分子，可能参与了贲门癌的多种生物学行为，可作为特异性的肿瘤转移或分化标志物，在预测贲门癌淋巴结转移潜能、治疗或预后判断方面起重要作用，以HIF-1α、VEGF-C为靶点的治疗策略可能能够抑制肿瘤的淋巴结转移。

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［2］赵 菲，蔡慧云，安 平.缺氧诱导因子-lα在结肠肿瘤中的表达及意义〔J〕.中华消化外科杂志，2007，6(2):125.

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［7］栾 宁，王雪峰.VEGF-C与肿瘤转移的研究进展〔J〕.现代肿瘤医学，2009，17(9):1805.

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［9］Skobe M，Hawighorst T，Jackson DG，et al.Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis〔J〕.Nat Med，2001，7(2):192.

［10］Tao J，Li T，Li K，et al.Effect of HIF-1alpha on VEGF-C induced lymphangiogenesis and lymph nodes metastases of pancreatic cancer〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26(5):562.

［11］Katsuta M，Miyashita M，Makinoa H，et al.Correlation of hypoxia inducible factor-1a with lymphatic metastasis via vascular endothelial growth factor-C in human esophageal cancer〔J〕.Exp Mol Pathol，2005，78(2):123.