宫颈癌组织中CD146和MMP-14表达的意义及相关性分析

朱 燕 杨其昌 刘宏斌 刘曼华 张晓娟 沈 屹

黏附分子CD146(Mel-CAM)是新近发现的新生血管标志物，介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的黏附，其过度表达能促进肿瘤血管生成及远处转移;基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)能降解细胞外基质(extra cellularmatrix，ECM)及基膜(basementmembrane，BM)成分，是促进肿瘤浸润转移的1种重要的酶类，其中主要成员有MMP-14等。本文通过检测CD146、MMP-14在宫颈鳞癌中联合表达情况，旨在探讨它们在宫颈癌发生、发展及血管生成中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

收集我院1998年～2008年手术切除的82例宫颈鳞癌标本作为实验组，该组患者术前均未给予化疗和放疗，年龄32～81岁，中位年龄53岁。按照Broders分类标准分类［1］:鳞癌Ⅰ级 24 例(29.27%);Ⅱ级33 例(40.24%);Ⅲ级 25 例(30.49%)。按照 FIGO临床分期标准进行分期［2］:Ⅰ期 +Ⅱ期 61例(74.39%)，Ⅲ期 +Ⅳ期 21 例(25.61%)。按照淋巴结转移情况分组:无淋巴结转移62例(75.61%);有淋巴结转移20 例(24.39%)。参照文献方法［3］，82 例宫颈癌按间质浸润情况分组:侵及或未侵及浅肌层25例(30.49%);侵至深肌层 57例(69.51%)。收集同期慢性宫颈炎24例及CIN 48例(CINⅡ级27例，Ⅲ级21例)作为对照组。所有标本均经病理检查确诊。

1.2 方法

所有标本均经10%中性福尔马林液固定，常规处理，石蜡包埋，4 μm连续切片，进行HE染色及免疫组织化学SP法染色，鼠抗人单克隆抗体CD146(工作浓度1∶30)、MMP-14(工作浓度1∶60)均购自北京中杉金桥生物有限公司。用 PBS液取材一抗作为阴性对照，用试剂公司提供的阳性切片作为阳性对照。

1.3 免疫组化结果判断标准

CD146阳性表达呈棕黄色细颗粒，主要定位于癌及癌旁组织的血管内皮，部分表达于癌细胞。CD146标记的微血管数量用MVD值表示。MVD测定参照Weidner［4］方法，首先在低倍镜( ×40)下观察全部视野，在每张切片上选择3个富含血管组织的“热点”区，即棕黄染色密度最高的区域，然后，在高倍镜(×100)下计数热区CD146表达的血管数目，凡单个或聚集在一起的数个被染为棕黄色或棕褐色的内皮细胞，只要与邻近血管、肿瘤细胞和其他结缔组织成分清楚分开的即为1个能够计数的微血管。肌层太厚及血管腔面积大于8个红细胞直径的血管均不计数。取3个视野的微血管数，由计算机自动标记及分析，并求和取平均值作为该例MVD。

MMP-14免疫组化阳性染色为棕黄色颗粒，位于肿瘤细胞胞质。阳性反应的分级参照文献［5］采用兼顾阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比的判断标准:每张切片随机选取5个高倍视野，首先按阳性细胞所占百分比评分:阴性为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分;再按染色强度评分:无色为0，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;最后按两者乘积分数分为4个等级:－(0、1、2分)，+(3、4 分)，++(6、8 分)，+++(9、12 分)。

1.4 统计分析

采用美国计算机研究中心研制的Stata 7.0统计软件包进行。MVD值以s表示。不同组间的MVD比较采用t检验、F检验，率的比较采用χ2检验。相关性分析用列联相关系数。检验水准α =0.05。

2 结果

2.1 各组织中CD146蛋白表达的情况

CD146表达主要定位于癌组织及癌旁组织的血管内皮细胞膜上，部分表达于癌细胞。CD146在CIN中呈不同程度的表达，在正常宫颈上皮中表达较弱。不同宫颈病变组织中CD146标记的MVD结果见表1。

表1 不同宫颈病变组织中CD146标记的MVD比较(s)

表1 不同宫颈病变组织中CD146标记的MVD比较(s)

注:F*为单因素方差分析

组别 例数 CD146标记的MVD F*P 82 33.76 ±7.32 96.37 0.000宫颈上皮内瘤变 48 24.49 ±4.21慢性宫颈炎宫颈鳞癌24 5.81 ±2.43

由表1可见，3组CD146标记的MVD存在显著差异，进一步分析显示，宫颈鳞癌组织 CD146标记的MVD显著高于CIN及慢性宫颈炎组织(P＜0.01)。

2.2 CD146标记的MVD与宫颈鳞癌临床病理因素的关系(表2)

表2 CD146标记的MVD与宫颈鳞癌临床病理因素的关系(s)

t P年龄(岁)临床病理因素 例数 CD146标记的MVD≤53 39 32.47 ±6.52＞53 43 34.91 ±7.92 －1.51 0.13浸润深度≤浅肌层 25 25.76 ±6.32＞深肌层 57 38.59±4.48 －10.48 0.00组织学分级Ⅰ级 24 24.82 ±5.29Ⅱ级 33 32.38 ±7.27Ⅲ级 25 39.75 ±5.62 13.38 0.00淋巴结转移无62 28.27 ±5.46有20 39.72 ±3.19 －8.87 0.00 FIGO分期Ⅰ +Ⅱ期 61 28.59 ±5.91Ⅲ+Ⅳ期21 41.52 ±6.72 －8.34 0.00

由表2可见，CD146标记的MVD与肿瘤浸润深度、组织学分级、淋巴结转移及FIGO分期显著相关(P＜0.01)，CD146标记的 MVD与患者年龄无关(P＞0.05)。

2.3 各组织中MMP-14蛋白的表达情况

MMP-14蛋白主要定位于细胞质中，呈棕黄色。宫颈鳞癌组中72例(87.80%)呈阳性表达，CIN组中27例(56.25%)呈阳性表达，慢性宫颈炎组中2例呈弱阳性表达(8.33%)，3组阳性率比较差异显著(P＜0.01)。组间分析结果显示，MMP-14阳性率宫颈鳞癌组与CIN及慢性宫颈炎组比较均有显著性差异(P＜0.01)。

统计结果显示，MMP-14表达与宫颈鳞癌浸润深度、组织学分级、淋巴结转移和FIGO分期呈正相关，与患者年龄无相关性(表3)。

2.4 CD146与MMP-14蛋白表达的相关性

按照宫颈鳞癌中CD146标记的MVD均值30为界，分为LCD146(MVD≤30)(48例)和HCD146(MVD＞30)(34例)。用列联相关系数分析其与MMP-14表达的相关性(表4)。

表3 MMP-14表达与宫颈鳞癌临床病理因素的关系(例)

表4 宫颈鳞癌中CD146标记的MVD与MMP-14蛋白表达的相关性(例，%)

由表4可见，宫颈鳞癌组织中 CD146标记的MVD，与MMP-14蛋白表达呈正相关性(P＜0.01)，列联系数 Cramer＇s V 和 Goodman-Kruskal的 gamma均 ＞0。

3 讨论

CD146是1种Ca2+非依赖性细胞黏附分子的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族(Igsf)成员，介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，有助于局部黏连聚集、细胞骨架重组、细胞间相互作用、细胞形态的维持及细胞游走和增殖的调控［6］。近来研究发现CD146在许多恶性肿瘤组织中高表达，提示其与肿瘤发生发展及转移有关，可作为判断肿瘤预后的参考指标［7，8］。MMPs是一组 Zn2+依赖性的蛋白水解酶，能够降解多种基膜和细胞外基质成分，在肿瘤的浸润和转移过程中起重要作用。MMPs包含许多成员，其中MMP-14能活化细胞外基质结构蛋白的活性且能激活其它的MMPs，既可以直接和(或)间接降解ECM和BM，也可以诱导肿瘤血管生成，维持肿瘤的不断生长，并为肿瘤细胞进入循环系统转移提供条件。

我们的研究结果显示:CD146在宫颈鳞癌中表达主要定位于癌及癌旁组织的血管内皮细胞，在宫颈上皮内瘤变中见不同程度的表达，而在慢性宫颈炎上皮中表达较少。宫颈鳞癌组织中CD146标记的MVD显著高于其它各组。本研究结果显示，以CD146标记的宫颈鳞癌组MVD与患者年龄无关，但淋巴结转移阳性组CD146标记的MVD显著高于淋巴结阴性组。说明宫颈鳞癌淋巴道转移中伴有大量血管形成。其原因是肿瘤中大量新生血管形成，增加了肿瘤细胞的营养，使肿瘤细胞呈指数生长，并向周围浸润和淋巴结转移，同时CD146通过调节细胞间的黏附聚集、增殖参与肿瘤的浸润、转移过程。我们的结果提示CD146蛋白参与、促进宫颈上皮从癌前病变、原位癌到浸润癌的发生发展过程，其表达情况可作为判断宫颈癌发展进程的参考指标。这与马建华等［9］在前列腺中的研究结果及张龙云等［10］在卵巢癌中的研究结果基本一致。文献报道CD146在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌等恶性肿瘤中呈高水平表达，且表达水平与这些恶性肿瘤的发生发展、转移复发、血管生成及预后相关［9～12］，但也有文献报道［13］乳腺癌中CD146表达呈下调，与我们的结果及上述文献中CD146呈过表达相反，范嫏娣等认为这反映了肿瘤生物学的总体复杂性。

我们研究结果发现，MMP-14在宫颈鳞癌患者中的表达明显增强，说明宫颈鳞癌的侵袭性增强与MMP-14高表达有关，MMP-14在不同临床分期和不同组织学分级的宫颈鳞癌组织中，Ⅲ+Ⅳ期MMP-14表达强度显著高于Ⅰ+Ⅱ期;Ⅲ级MMP-14表达显著高于Ⅰ、Ⅱ级。提示MMP-14是宫颈鳞癌发生中1种重要的蛋白水解酶，能够降解多种基膜和细胞外基质成分，使宫颈鳞癌细胞易于穿透血管壁，由血循环进入淋巴循环，形成淋巴结的转移。Yamashita等［14］证实MMP-14在食管癌的进展期起关键作用。本组结果与他们研究结论一致，提示MMP-14可以作为反映宫颈癌侵袭转移能力的生物学标志物。

我们研究结果还显示，CD146表达与MMP-14表达密切相关。肿瘤转移过程需要肿瘤细胞进出血管系统，CD146阳性的肿瘤组织中的血管内皮细胞，通过与肿瘤细胞上的CD146配体结合，参与肿瘤细胞进出血管系统。所以，血管内皮细胞中表达的 CD146，为CD146配体阳性的肿瘤细胞进出血管提供了途径。肿瘤细胞中CD146-CD146配体间的相互作用则引起了肿瘤细胞的聚集，这些细胞团引起血管堵塞，继而黏附于血管内皮，CD146阳性的内皮细胞介导肿瘤细胞侵入周围组织。另外，CD146介导形成的肿瘤细胞团块促进了肿瘤细胞间的相互作用，分泌生长因子，也促进了肿瘤的生长。CD146参与肿瘤细胞的黏附、转移及新病灶的形成。而MMP蛋白能降解细胞外基质及基膜成分，亦能诱导肿瘤血管生成，目前研究表明MMP-14在多种肿瘤组织中呈过度表达，上调血管内皮生长因子促进肿瘤的生长和血管生成，协同参与多种肿瘤侵袭和转移过程。由此可知两者在肿瘤发展中确实存在着一定的相关性。总之，宫颈癌的发生、发展是多基因损伤、多级因子相互作用的复杂过程。

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