血浆EB病毒DNA数量与鼻咽癌细胞凋亡的相关性分析

王巍巍 黄大毛 王 雷 谢春蕾 唐发清

鼻咽癌是我国和东南亚1种常见的头颈部恶性肿瘤。EB病毒的感染与鼻咽癌的发生、发展密切相关［1，2］，在绝大多数鼻咽癌组织中可检测到 EBVDNA，鼻咽癌患者血浆EBV-DNA 检出率为94.1%［3］，EBV-DNA是鼻咽癌诊断和判断复发、转移的重要血清学标记物。而鼻咽癌患者血浆中EBV-DNA的来源目前尚不清楚，本文定量检测鼻咽癌患者血浆EBV-DNA拷贝数，并分析其与鼻咽癌细胞凋亡的相关性，为阐明鼻咽癌患者血浆中EBV-DNA的来源提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鼻咽癌患者28例为2006年5月至2008年1月中南大学湘雅医院耳鼻喉科收治的患者，经临床和病理检查确诊为鼻咽低分化鳞癌，其中男性16例，女性12例，年龄27～61(43.7±9.0)岁。每个患者收集病理组织切片，同时采集EDTA-Na2抗凝血3～5 ml。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品制备 取Raji细胞冻存液进行细胞计数，根据文献［4］报道每个Raji细胞约含有50个拷贝的EBV-DNA进行计算，得到Raji细胞冻存液中EBVDNA 浓度为6.95 ×105copies/μl。

1.2.2 巢式荧光定量PCR检测血浆中EBV-DNA使用病毒DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司产品)，分别从血浆和标准品中抽提病毒DNA，操作步骤按试剂盒说明书(稍加改进)进行。选择EB病毒DNA全序列20206～20426位为外扩增区，20279～20343位为内扩增区，荧光探针在内扩增区内20299～20318位。外扩增引物:上游引物为5’-TCAAAACTTTAGAGGCGAATGG-3’;下游引物为 5’-CTGAGAAGGTGGCCTAGCAAC-3’;扩增片段长度为221 bp。内扩增引物:上游引物 为 5’-CCAGGAAGCGGGTCTATGG-3’;下游引物为 5’-GGCTTA TTCCTCTTTTCCCCTCTA-3’;扩增片段长度为65 bp。荧光探针:Taqman探针序列5’-FAM-TGGCTGCGCTGCTGCTATC-TAMRA-3’。扩增引物、探针由广州达安基因股份有限公司设计合成。标准品的外扩增反应体系及反应条件:将Raji细胞抽提的EBV-DNA稀释成一定浓度梯度(1 ×108、1 ×107、1 ×106、1 ×105、1 ×104、1 ×103、1 × 102/50 μl反应体系)。50 μl反应体系:5 × 定性缓冲液10 μl，Taq DNA 聚合酶1 μl，dNTPs 1 μl，上游外引物 1 μl，下游外引物 1 μl，标准品 n μl(n为根据浓度计算的体积)，加水补至50 μl。反应条件:95℃ 5 min;95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30 个循环;72℃7 min。血浆样品的外扩增反应体系及反应条件。50 μl反应体系:5 × 定性缓冲液 10 μl，Taq DNA 聚合酶 1 μl，dNTPs 1 μl，上游外引物 1 μl，下游外引物 1 μl，模板 10 μl，加水补至 50 μl。反应条件:95℃ 5 min;95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30 个循环;72℃ 7 min。内扩增反应体系及反应条件:标准品与患者血浆样品相同。50 μl反应体系:5×定量缓冲液10 μl，Taq DNA 聚合酶 1 μl，dNTPs 1 μl，上游内引物1 μl，下游内引物 1 μl，Taqman 探针 1 μl，外扩增产物5 μl，加水补至 50 μl。反应条件:95℃ 5 min;95℃45 s，55℃ 45 s，40 个循环。

1.2.3 鼻咽癌细胞凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标记法，检测鼻咽癌细胞凋亡情况，操作按照In Situ Cell Death Detection Kit(Roche Diagnostics)试剂盒说明书进行。清洁载玻片经250℃烘烤4 h后，用2%3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液处理，鼻咽癌组织石蜡包埋4 μm切片后，置于处理后的载玻片上。二甲苯中脱蜡，乙醇水化，0.25%蛋白酶K消化后加入TUNEL反应液，湿盒中孵育37℃ 60 min，PBS洗涤后加1%Anti-FITC/AP，37℃湿盒中孵育30 min，PBS洗涤后加2%BCIP/NBT，于暗湿盒中显色，1%甲基绿复染，流水冲洗后烤干，中性树酯封片，显微镜下观察。阳性细胞的细胞核或细胞质出现紫蓝色颗粒，以反应性增生的淋巴结作为阳性对照，在高倍视野下，对每例组织切片中癌组织区域连续数1 000个细胞，计算其中阳性细胞所占比率，即凋亡指数(apopototic index，AI)。

1.3 统计学处理

应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析，采用Spearman秩相关及检验。

2 结果

2.1 鼻咽癌患者中血浆EBV-DNA的表达

应用巢式荧光定量PCR方法，检测患者血浆EBV-DNA，以Raji细胞作为标准品对EBV-DNA进行相对定量，计算不同患者血浆EBV-DNA的拷贝数及血浆EBV-DNA中位数。结果显示，鼻咽癌患者血浆EBV-DNA检出率为96.4%(27/28)，中位数为1 800 copies/μl(0 ～22 100 copies/μl)。

2.2 鼻咽癌细胞凋亡检测

应用TUNEL方法检测鼻咽癌细胞凋亡，阳性细胞的细胞核或细胞质出现蓝紫色颗粒。光镜下用高倍视野，对每例组织切片癌组织区域连续数1000个细胞，计算其中阳性细胞所占比例，即凋亡指数。结果显示，28例鼻咽癌活检组织中肿瘤细胞平均凋亡指数为30.0 ±18.0。

2.3 鼻咽癌患者血浆EBV-DNA与细胞凋亡的相关性

排除EBV-DNA阴性患者及细胞凋亡指数为阴性患者，鼻咽癌患者中血浆EBV-DNA水平与细胞凋亡呈正相关性(γ =0.927，P ＜0.05)(图1)。

图1 鼻咽癌患者EBV-DNA水平与细胞凋亡指数的相关性

3 讨论

EB病毒是1种全球广为分布、普遍存在的人疱疹病毒，大约90%的人群感染EB病毒。EB病毒感染后主要以潜伏感染的方式存在，介导一些与细胞生长、肿瘤形成有关的重要基因异常表达，从而促使细胞恶性转化，导致肿瘤发生(如鼻咽癌、Burkitt’s和Hodfkin’s淋巴瘤等)［5］。EB病毒与鼻咽癌关系密切，在绝大多数鼻咽癌患者癌细胞中均存在EB病毒基因组成分［6］，大量研究表明鼻咽癌患者血浆中可以检测到游离的 EBV-DNA［7，8］，EBV-DNA 已经成为鼻咽癌早期诊断和临床分期的重要指标之一［9，10］。本研究中，我们应用Raji细胞中EB病毒基因线性整合在宿主细胞中、每个Raji细胞约含50～60个拷贝的EB病毒基因［4］的特点，制备不同浓度的EBV-DNA标准品，然后采用巢式荧光定量PCR方法，对鼻咽癌患者血浆样本进行定量分析，结果显示鼻咽癌患者血浆EBV-DNA检出率为96.4%，与文献报道的一致，而且EBV-DNA定量检测的直观数据将为鼻咽癌的疗效评价和复发、转移监测提供直接依据［11］。

鼻咽癌患者血浆EBV-DNA检测的重要性已得到普遍认可，然而血浆中EBV-DNA的来源一直是人们争议的热点。最初学者认为，在鼻咽癌外周血中能检测到EB病毒DNA是因为在外周单个核细胞中存在BE病毒复制，但这与EB病毒DNA水平变化与鼻咽癌肿瘤的消长相关相悖。随后研究发现鼻咽癌患者血浆存在大量游离于细胞外的的 EBV-DNA，并发现EBV-DNA随着肿瘤消长而变化，在肿瘤消退和持续缓解后EBV-DNA降低，而在肿瘤恶化、复发和扩散转移时EBV-DNA升高［12］，由此推测血浆EBV-DNA与鼻咽癌瘤体组织有关。进一步研究表明，EBV主要分布于鼻咽上皮中，在鼻咽上皮细胞中病毒基因组自身环化形成附加体，融合于宿主细胞DNA的单一末端，随着细胞的复制而同步进行复制，仅少数分布于外周血白细胞［13］。鼻咽癌患者血清EBV-DNA有可能是从携带EBV鼻咽癌细胞中释放出来的。

为进一步明确鼻咽癌患者血清EBV-DNA来源鼻咽癌细胞，本项目对比分析了鼻咽癌患者血清EBVDNA和鼻咽癌细胞凋亡间关系，以探讨血清 EBVDNA来源于凋亡的鼻咽癌细胞。本实验采用TUNEL法检测鼻咽癌细胞凋亡情况，巢式荧光定量PCR法检测EBV-DNA拷贝数，分析血清EBV-DNA与鼻咽癌细胞凋亡数的相关性。结果发现，鼻咽癌患者血浆中EBV-DNA拷贝数与癌细胞凋亡数呈正相关，提示EBV-DNA可能部分来源于凋亡的肿瘤细胞。有学者曾经提出血浆EBV-DNA可能是肿瘤细胞凋亡的标志［14］，最近研究表明鼻咽癌患者外周血单个核细胞中的EB病毒DNA也可能来源于凋亡的肿瘤细胞［15］。因而，我们认为，鼻咽癌患者血浆中的EBV-DNA可能来源于凋亡的肿瘤细胞，但EBV-DNA从凋亡的肿瘤细胞进入血循环系统的机制尚需进一步研究。

EBV感染可以抑制鼻咽癌患者细胞免疫功能，使病情进一步发展［16］，EBV-DNA作为鼻咽癌肿瘤细胞凋亡的指标，可以通过定量检测患者血浆EBV-DNA来提示肿瘤消长情况，因而，血浆EBV-DNA，可以作为鼻咽癌早期诊断、疗效评价、检测复发转移以及高危人群预防的1项重要指标。

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