p16与eIF4E在宫颈癌中基因改变情况的初步研究
2011-11-15郑晓娟胡新荣唐泽立李飞虹庞天云
郑晓娟 胡新荣 唐泽立 李飞虹 庞天云
宫颈癌是严重危害妇女生命健康的恶性肿瘤,全球发病率居第二位,在我国则是妇科恶性肿瘤的第一位死亡原因。宫颈癌起源于正常宫颈上皮,进而发展为宫颈上皮内瘤变(CIN),再经过几年或十几年可发展为浸润癌[1,2]。因此,寻找与宫颈癌发生发展有关的分子标志,是早期提示、诊断宫颈癌的关键。p16与宫颈癌的关系是近年来这一研究领域的热点。eIF4E位于宫颈肿瘤LOH常发生的染色体之一的4q24,cDNA长1 683 bp。在宫颈肿瘤中eIF4E的基因型究竟为何种改变尚不清楚。本实验运用PCR技术对宫颈癌中p16及eIF4E进行检测,以期发现与宫颈癌的发生发展相关的分子标志。
1 材料与方法
1.1 标本来源及处理
本研究资料取自广东医学院附属医院妇产科2004~2006年间手术切除的41例新鲜宫颈癌标本。新鲜组织自患者体内取出后,立即送病理科由经验丰富的病理科医师取材,取材内容包括宫颈癌组织和癌旁正常宫颈组织,并装入冻存管中,置于-80℃冰箱密封保存备用。切片时置于-20℃冷冻切片机中,6~8 μm连续切片,切片亦置于-80℃低温冰箱中保存备用。
1.2 主要试剂
微量DNA提取试剂盒,p16exon1、eIF4E的引物,琼脂糖凝胶,50 bp DNA ladder,溴化乙锭(EB)。
实验所用引物为B-globin(产物长度:102 bp):S 5 '-gTg CAT CTg ACT CCT gAg gAg A-3 ',A 5 '-CCT TgA TAC CAA CCT gCC CAg-3';p16exon1(产物长度:269bp):S 5 '-CCT TgC CTg gAA AgA TAC Cg-3 ',A 5 '-gCA CCT CCT CTA CCC gAC CC-3';eIF4E(产物长度:244bp):S 5 '-AAA Cgg AAT CTA ATC Agg Ag-3 ',A 5 '-CAC ATA ggC TCA ATA CCA TC-3'。
1.3 主要仪器
倒置显微镜,台式离心机,752型紫外分光光度计,PCR扩增仪,稳压稳流电泳仪,紫外透射分析仪。
1.4 实验方法
选取正常宫颈组织和宫颈癌这两个起始端和终端,检测如下2个基因:p16exon1,eIF4E。将苏木精轻染的宫颈癌切片置于倒置显微镜载物台上,10倍镜下手持清洁手术刀片在需要切割的区域来回刻划,用刀片蘸取少量裂解液黏取游离的细胞,将其转移到装有200 μl裂解液的冻存管中,细胞大约盖满管底即可,然后使用微量DNA提取试剂盒提取制备DNA。将每一例样本的正常宫颈组织和癌组织进行配对,测定所提取宫颈癌组织及癌旁正常组织DNA的OD值,在25 μl的PCR反应体系中,均统一加入0.8 μg模板DNA。在同一批次分别针对待检基因和相应的看家基因做PCR,电泳时在同1个加样孔中分别加入两种产物各8 μl,待电泳结束后,对凝胶进行染色。按照同样的方法对上述2个基因各重复检测2次。
1.5 电泳图像分析
运用bandscan4.3对电泳图像中的各个泳带进行灰度扫描,取两次实验灰度值的均值。计算出待检基因扩增产物灰度值与相应看家基因扩增产物灰度值的比值,以这一比值作为校正值(相对灰度),运用SPSS13.0进行统计学分析,根据处理结果确定基因的扩增或丢失情况。
2 结果
抑癌基因p16exon1在宫颈癌中的拷贝数改变:p16exon1在宫颈癌组织中相对灰度的均值为0.28,在正常宫颈组织中相对灰度的均值为0.11。经配对样本 t检验,t= -2.766,P(双)=0.028,两者相比有统计学意义,见图1。
癌基因eIF4E在宫颈癌中的拷贝数改变:eIF4E在宫颈癌组织中相对灰度的均值为1.08,在正常宫颈组织中相对灰度的均值为0.72。经配对样本t检验,t= -2.744,P(双)=0.029,两者相比有统计学意义,见图2。
以下电泳图中相邻两泳道为同一例样本,奇数泳道为正常组织,偶数泳道为癌组织,“M”为50 bp DNA ladder。
图1 正常宫颈组织与宫颈癌中p16exon1的基因扩增情况
图2 正常宫颈组织与宫颈癌中eIF4E的基因扩增情况
3 讨论
本实验结果显示,p16exon1在宫颈癌组织中扩增产物的拷贝数较癌旁正常组织明显增加,两者相比有统计学意义。从中初步推断,p16的第1个外显子参与了宫颈癌的发生发展。这从基因水平上解释了p16蛋白表达增高的原因。以往大多是用免疫组化的方法检测p16蛋白的表达情况,发现p16蛋白的表达随着宫颈病变发展程度的增高,其累积量也逐渐增高,但这并不能揭示p16基因的结构异常。本实验结果说明,p16exon1的基因结构发生了改变,表现为扩增,由此可引起其蛋白表达的增高。p16的第2、3个外显子是否也是同样的情况,尚需进一步检测。
迄今,在宫颈癌的发生发展过程中,对于p16在基因水平方面的报道还比较有限。Wong等[3]研究了128例宫颈癌中p16的缺失情况,发现其中7例有纯合性缺失,比例为5%。亦有文献报道,采用PCR的方法对p16的第1和第2个外显子进行了纯合性缺失检测,得出如下结果,在60例宫颈癌中,9例有第1或第2个外显子的纯合性缺失,比例为15%[4]。本实验即是对p16在分子水平方面的改变进行了初步研究,后续仍有极大的研究空间,可进行更深入的探索。
eIF4E即真核细胞翻译起始因子4E,与蛋白合成的起始反应有关,其活性受ras,c-myc等基因的正性调控。在实体肿瘤发展中,恶性组织的增殖需要大量蛋白的合成,eIF4E表达增高属必然事件。eIF4E作为原癌基因,其作用是通过加强各种原癌基因的翻译而实现的。Lee等[5]运用免疫组化的方法发现,eIF4E在正常宫颈鳞状上皮中没有表达,随着宫颈病变的级别增高,其表达逐渐增强,且其表达具有显著统计学意义;同时运用实时定量反转录PCR检测发现,在宫颈肿瘤中eIF4E的表达较正常宫颈上皮明显增强,其差异亦有显著统计学意义。也有文献报道,eIF4E在宫颈肿瘤中的表达增加,并可促进HPV E7基因的表达[6]。这些都表现了它作为癌基因的特性。本实验结果显示,eIF4E在宫颈癌组织中较癌旁正常组织中扩增产物的拷贝数明显增加,两者相比有统计学意义。从中初步推断,与正常宫颈组织相比,eIF4E在宫颈癌中表现为扩增;并可推测其蛋白在宫颈癌中亦为过量表达。从eIF4E本身的特性(为癌基因)来讲,我们较容易理解其表现为扩增的事实。目前尚未见到有具体研究eIF4E的基因型改变的报道。
本实验从基因结构的改变方面表明了p16可以作为宫颈癌发生发展的有用的分子标志。目前在宫颈癌的研究中,有关eIF4E的报道较少,在本实验中亦是对其进行初步研究,根据实验结果,可初步考虑把该基因作为宫颈癌发生发展过程中的候选分子标志。p16第2、3个外显子在宫颈癌中的基因改变情况如何,以及eIF4E是否可作为宫颈癌发生发展方向的确切分子标志,尚需进一步研究。
[1]Spitzer M,Apgar B,Brotzman G.Management of histologic abnormalities of the cervix〔J〕.Am Fam Physician,2006,73(1):105.
[2]Lau S,Franco EL.Management of low-grade cervical lesions in young women〔J〕.CMAJ,2005,173(7):771.
[3]Wong YF,Chung TK,Cheung TH,et al.p16INK4 and p15-INK4B alterations in primary gynecologic malignancy〔J〕.Gynecol Oncol,1997,65(2):319.
[4]Yuan JR,Li Y,Hu SJ,et al.Methylation and aberrant expression of thep16 gene in cervical carcinoma〔J〕.HEREDITAS(Beijing),2005,27(1):39.
[5]Lee JW,Choi JJ,Lee KM,et al.eIF-4E expression is associated with histopathologic grades in cervical neoplasia〔J〕.Hum Pathol,2005,36(11):1197.
[6]Matthews-Greer J,Caldito G,de Benedetti A,et al.eIF4E as a marker for cervical neoplasia〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol,2005,3(4):367.