β-榄香烯的放疗增敏作用与肿瘤血管形成的相关性研究

樊 辉 李国权 谢冰冰 陈英海 李小龙 邹丽娟

放射治疗是抗肿瘤治疗的主要治疗方法之一，通过放疗和增敏剂的联合应用提高放疗疗效，是基础和临床研究的热点。β-榄香烯是从姜科植物温郁金中提取出来的抗癌新药，是1种高效、低毒的广谱抗肿瘤药物，而且β-榄香烯的放疗增敏作用已经得到证实，但是放射增敏机制仍未完全阐明。我们通过探讨β-榄香烯对移植瘤的放疗增敏机制，是否与血管形成相关，从而为阐明增敏机制提供新的理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和裸鼠 A549人肺腺癌细胞系购自中国医学科学院细胞库。6～8周龄的BALB/C-nu裸鼠购自大连医科大学实验动物中心，恒温(24℃ ～26℃)饲养。笼具、垫料、饮水及饲料均作高压和紫外线消毒处理。

1.1.2 主要试剂 β-榄香烯注射液购于大连华立金港药业有限公司。VEGF、CD34多克隆抗体、生物素标记山羊抗兔和山羊抗鼠IgG及SP染色试剂盒，均购自于北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞置于37℃、5%饱和湿度CO2培养箱中，用PRMI 1640完全培养液培养，每2～3 d换液1次，定期传代。

1.2.2 移植瘤模型 取对数生长期细胞，应用无血清培养基配备细胞悬液，最终细胞浓度为1×107个/0.2 ml;裸鼠右下肢外侧皮下注入0.2 ml瘤细胞悬液。应用游标卡尺由专人定期测量瘤体的长径(a)及短径(b)，计算移植瘤体积(V=ab2/2［1］)。

1.2.3 照射方式 将荷瘤裸鼠装入一有机玻璃盒内，接种肿瘤的后腿拉出用胶布固定。肿瘤部位位于照射野中央，距野边缘均超过1 cm，全身其余部位均在野外。Varian 2 300C/D医用直线加速器，6 MeV电子线，照射野4 cm×3 cm，剂量5 Gy，源皮距100 cm，照射部位上垫1.0 cm厚蜡块。

1.2.4 肿瘤生长延缓时间和计算增敏系数 待移植瘤体积达0.8～1.0 cm3时，将荷瘤裸鼠随机分组:空白组(NaCl)、25 mg/kg药物组、45 mg/kg药物组、100 mg/kg药物组、放疗组(NaCl+放疗)、25 mg/kg+放疗组、45 mg/kg+放疗组、100 mg/kg+放疗组，每组5只。腹腔注射β-榄香烯，空白组注射同等体积生理盐水。与放疗联合时，β-榄香烯于放疗前1h腹腔注射。观测移植瘤的体积倍增时间，绝对肿瘤生长延缓时间(AGD)=放疗组体积倍增时间－空白组体积倍增时间。标准化肿瘤生长延缓时间(NGD)=联合组体积倍增时间－药物组体积倍增时间。增敏系数(EF)=NGD/AGD，EF＞1提示有放射增敏效应［2］。

1.2.5 移植瘤取材 再次将瘤体达到0.8～1.0 cm3的新裸鼠随机分组，具体:空白组(NaCl);药物组(最佳增敏剂量)、放疗组、药物+放疗组。24 h后采用断颈法处死裸鼠，立刻置于冰上，用无菌手术器具剥取肿瘤组织，去除脂肪等非瘤组织，置于保存管里于液氮罐保存。

1.2.6 石蜡切片制备及VEGF、CD34免疫组化染色新鲜肿瘤标本常规石蜡包埋，切成4 μm厚连续切片。采用SP法免疫组化染色，按照试剂盒说明书进行操作。采用IPP软件(Image-Pro Plus 6.0)对VEGF的染色结果进行分析，选择测量面积计算累积光密度及平均光密度［3］。参照 Weidner［4］微血管计数法标准，根据CD34染色阳性细胞，计数MVD平均数目。

1.3 统计学分析

应用SPSS 16.0统计分析软件，采用单因素方差分析方法，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组裸鼠移植瘤的体积倍增时间

实验前各组瘤体积差异无统计学意义(P＞0.05)。隔日检测移植瘤体积变化，计算各组的体积倍增时间。由图1可见，各药物组与空白组(6.8±1.10)比较倍增时间均延长，差异有统计学意义(P＜0.01)。药物组间倍增时间比较，100 mg/kg组(17.2±1.92)最长，45 mg/kg 组(10.6 ± 1.14)次之，25 mg/kg组(9.0 ±0.71)最短，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。放疗组倍增时间(11.8 ±0.45)短于 100 mg/kg组，差异有统计学意义(P＜0.01)，长于 45 mg/kg组，两者比较无统计学意义(P＞0.05)。

图1 各实验组的体积倍增时间

2.2 增敏系数(EF)和最佳增敏剂量

根据NGD和AGD计算增敏系数，由于25 mg/kg组EF=0.84＜1，提示该剂量没有放疗增敏作用。45 mg/kg组(EF=1.24)和 100 mg/kg组(EF=2.04)的EF值均＞1，说明两种剂量具有增敏作用。由图1可见，100 mg/kg β-榄香烯的抑瘤能力超过了放疗的抑瘤能力，说明该剂量抑瘤能力过强，因此不是理想的增敏剂量。45 mg/kg符合放射增敏剂量的要求。

2.3 各组移植瘤VEGF免疫组化表达

显微镜下观察细胞质染色呈棕黄色或棕褐色者为VEGF表达阳性。依据累积光密度及平均光密度结果分析各组VEGF的表达水平，见表1。累积光密度结果:药物组VEGF表达水平略低于空白组，但是两者差异无统计学意义(P＞0.05);放疗组与空白组及药物组比较，VEGF表达明显增强，差异有统计学意义(P＜0.01)，联合组与空白组、药物组及放疗组比较VEGF表达明显减弱，差异有统计学意义(P＜0.01)。各组平均光密度分析结果与累积光密度结果一致。

表1 各组VEGF免疫组化染色结果的IPP图像分析(s)

表1 各组VEGF免疫组化染色结果的IPP图像分析(s)

★为与空白组、药物组比较，P＜0.01;◆为与其它各组比较，P＜0.01

组别 样本数(n)累积光密度 平均光密度(×10－2)空白组◆

2.4 移植瘤CD34免疫组化表达

参照Weidner微血管计数法标准，以细胞质出现棕黄色着色为血管内皮细胞阳性。CD34免疫组化结果见表2。药物组的微血管个数表达略低于空白组，但两者差异无统计学意义(P＞0.05);放疗组与空白组及药物组比较，微血管个数表达明显增强，差异有统计学意义(P＜0.01)，联合组与空白组、药物组及放疗组比较，微血管个数表达明显减弱，差异有统计学意义(P ＜0.01)。

表2 各组CD34免疫组化染色结果

3 讨论

β-榄香烯是从中药莪术中提取出来的具有抗癌活性的药物，由于其高效，低毒，广谱的特点越来越多的受到临床治疗的青睐。基础研究证明β-榄香烯对肺腺癌 A549［5］、小鼠移植瘤 U14［6］等多种细胞均具有放射增敏作用。放射增敏机制研究主要涉及到细胞周期、细胞凋亡及 DNA 双链损伤修复等方面［7，8］，而且主要是体外实验。体内实验及在肿瘤血管形成机制方面研究甚少。

VEGF是目前发现的活性和专属性最强的血管生成因子［9］，广泛表达于肿瘤细胞，在肿瘤血管形成机制方面发挥至关重要的作用，所以我们选择了VEGF做为研究的主要目标。VEGF的表达与肿瘤微血管密度(MVD)紧密相关［10］，所以本实验着重研究β-榄香烯的放疗增敏机制与VEGF和MVD表达的相关性。

本实验的前期整体实验发现，45 mg/kg药物组剂量本身的抑瘤能力较弱，而增敏系数(EF=1.24)较理想，所以选择此剂量作为进一步研究的增敏剂量。从本实验的结果也可看出:药物组VEGF的免疫组化表达与空白组比较差异不大，无统计学意义。Moeller等［11］研究表明放疗会诱导肿瘤HIF-1α表达上调，从而促进其下游众多分子(如VEGF等)的表达。本实验结果也证明了这一点，VEGF免疫组化结果可看出放疗组表达明显增强，与空白对照组有明显差异。而联合组VEGF表达水平明显低于其他各组。CD34各组表达与VEGF表达结果基本吻合。这说明了β-榄香烯和放疗协同，通过抑制VEGF表达，改善肿瘤的血管形成情况，增强了肿瘤细胞的放射敏感性，其机制可能是通过下调VEGF表达改善了肿瘤的乏氧状态，值得进一步研究。

［1］Liu XF，Xia YF，Li MZ，et al.The effect of p21 antisense oligodeoxynucleotides on the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells with normal p53 function〔J〕.Cell Biol Int，2006，30(3):283.

［2］Milas L，Fujii T，Hunter N，et al.Enhancement of tumor radioresponse in vivo by gemcitabine〔J〕.Clin Cancer Res，1999，59(1):107.

［3］Wang CJ，Zhou ZG，Holmqvist A，et al.Survivin expression quantified by Image Pro-Plus compared with visual assessment〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2009，17(6):530.

［4］Weidner N，Semple JP，Welch WR，et al.Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma〔J〕.N Engl J Med，1991，324(1):1.

［5］Jiang H，Ma SL，Feng JG.In vitro study of radiosensitization by β-elemene in A549 cell line from adenocarcinoma of lung〔J〕.C-G JCO，2009，8(1):12.

［6］邹丽娟，孙秀华，徐晓颖，等.榄香烯对小鼠移植瘤U14放疗增敏的实验研究〔J〕.中华放射医学与防护杂志，2004，24(3):254.

［7］张 卓，邹丽娟，田莹莹.β-榄香烯乳联合照射对DNAPKcs基因表达及凋亡的影响〔J〕.实用癌症杂志，2009，24(6):555.

［8］张 卓，邹丽娟，田莹莹.β-榄香烯乳联合照射对肺腺癌A549细胞凋亡及KU70基因表达的影响〔J〕.中国肿瘤临床，2010，37(4):184.

［9］Links Inda AM，Andrini LB，Garcla MN，et al.Evaluation of angiogenesis with expression of VEGF and CD34 in human non small cell lung cancer〔J〕.J Exp Clin Cancer Res，2007，26(3):375.

［10］Volta M，Koomagi R，Mattern J.Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer〔J〕.Jnt J Cancer，1997，74(1):64.

［11］Moeller BJ，Cao Y，Li CY，et al.Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors:role of reoxygenation，free radicals，and stress granules〔J〕.Cancer Cell，2004，5(5):429.