乙型肝炎病毒前S2区缺失突变与肝癌相关性研究

强福林 吴徐明 杨自力 崔晓燕 李海波

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来的资料特别发现，至少有80%的肝细胞肝癌患者有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染［1，2］。前S1、前S2基因合并称为前S基因，两者编码的蛋白在病毒与细胞特异性结合方面起着重要作用。前S区是HBV 基因组中变异发生较多的部位［3，4］，研究表明，在HBsAg阳性人群中，有18.3%的人存在前S基因的突变，而中国人突变的比例则高达22.4%。

南通地区是我国乙型肝炎的高发区，同时也是我国肝癌的高发地区，多年来一直是我国乙型肝炎及肝癌重要的研究现场［5］。我们现就南通地区肝癌患者血清HBV PreS2区的缺失突变情况作一研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

HBV无症状携带者(asymptomatic HBV carriers，ASC)，均为到南通市疾病预防控制中心进行健康体检者，年龄21～39岁，均未接种过乙型肝炎疫苗，也未使用过任何抗HBV药物，体检结果显示肝功能均正常。肝癌(hepatocarcinoma，HCC)患者均为南通市肿瘤医院住院治疗的肝癌患者，年龄42～67岁。上述HBV无症状携带着和肝癌患者均符合中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会联合修订的诊断标准［6］，血清样品均保存于－70℃低温冰箱。

1.2 主要试剂及引物

肝炎病毒诊断试剂(HBsAg、抗-HAV-IgM、抗-HDV、抗HCV)均购自上海科华生物工程股份有限公司，HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒购自深圳匹基生物技术开发有限公司，谷丙转氨酶 (ALT)试剂盒为Wako公司产品。PreS扩增引物根据 PUBMED中HBV序列设计，由上海之江生物技术公司合成。上游引物 P1:5’-TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’(2817～2836 nt)，下游引物 P2:5’-GAG AGA AGT CCA CCA CGA GT-3’(252～271 nt)，目的基因长度为670 bp。

1.3 实验方法

乙型肝炎病毒抗原、抗体，甲型肝炎IgM抗体，丙型肝炎抗体，丁型肝炎抗体，血清ALT，HBV-DNA，均严格按照试剂说明书操作。

HBV PreS基因的扩增:采用酚-氯仿法抽提血清DNA，PCR 条件为预变性 94℃ 25 min，94℃ 20 sec，50℃ 30 sec，72℃ 1 min，共40个循环，最后一个循环72℃10 min。PCR产物纯化后送上海之江生物技术公司测序，引物为P1。将所测基因序列与HBV不同型PreS序列用DNAMAN软件比对。

2 结果

2.1 HBV无症状携带者和肝癌患者HBV preS2缺失突变情况

在实验中，首先筛选出甲肝IgM抗体、丙型肝炎抗体和丁型肝炎抗体检测均为阴性的研究对象，以排除其他肝炎感染对本研究结果的影响。与HBV无症状携带组相比较，肝癌组ALT水平显著增高，而两组HBV-DNA浓度并无显著差异。在肝癌组中，23.08%的患者存在PreS2区的缺失突变，与无症状携带者比较有显著差异(表1)。

表1 HBV无症状携带者和肝癌患者HBV PreS2缺失突变情况

2.2 肝癌患者HBV preS2缺失突变分析

与HBV野毒株相比较，本研究的26例肝癌患者中，有6位存在着HBV preS2区的缺失突变，缺失长度分别为30～45 bp，对应缺失10～15个氨基酸。缺失的位点在aa 126～141区域(表2)。

表2 肝癌患者HBV preS2缺失突变病例

3 讨论

肝癌的发病机理十分复杂，HBV感染及HBV基因组的多态性可能显著影响病毒与宿主的相互关系及患者的临床过程，HBV基因组的变异可能与肝癌的发生、发展存在某种联系。

前S基因与HBV病毒的一些重要生理功能有关，其变异将影响疾病的发生、发展进程。前S基因变异，特别是前S2基因起始密码的变异，可能是导致肝炎重症化的原因之一。多个研究小组报道了前S基因的缺失突变，最长的缺失突变可达264 bp，最短的为9 bp，研究表明，这大多是由真核细胞mRNA剪接机制，以及HBV DNA聚合酶所具有的逆转录酶活性参与DNA模板转换机制等造成的部分基因缺失突变［7，8］。

已有研究结果表明肝癌的发展与HBV preS2及其突变相关。HBV preS2可抑制p53而导致肝癌的发生;HBV preS2突变通过p27(Kip1)的降解而导致了DNA损伤;HBV preS2突变可通过Cdk2途径而导致视网膜母细胞瘤抑癌基因过磷酸化［9，10］。

本研究发现，在肝癌患者HBV preS2中存在大量的缺失突变，而Genbank收录的无症状携带者的preS2基因，以及本研究测定的无症状携带者的pre-S2基因并无大量缺失突变发生，提示肝癌患者HBV前S基因为高度变异区，而preS2区的缺失突变则可能与肝癌的发生密切相关。

［1］Liu S，Zhang H，Gu C，et al.Associations between hepatitis B virus mutations and the risk of hepatocellular carcinoma:a meta-analysis〔J〕.J Natl Cancer Inst，2009，101(15):1066

［2］Ferenci P，Fried M，Labrecque D，et al.Hepatocellular carcinoma(HCC):a global perspective〔J〕.J Clin Gastroenterol，2010，44(4):239

［3］Abbas N，Ahmad A，Shakoori AR，et al.Overexpression and purification of PreS region of hepatitis B virus antigenic surface protein adr subtype in Escherichia coli〔J〕.J Biochem Mol Biol，2007，40(6):1002

［4］吴 炜，李兰娟.HBV前S基因变异及其临床意义〔J〕.国外医学·流行病学传染病分册，2002，29(4):200

［5］Wang JS，Qian GS，Zarba A，et al.Temporal patterns of aflatoxin-albumin adducts in hepatitis B surface antigen-positive and antigen-negative residents of Daxin，Qidong County，People＇s Republic of China〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1996，5(4):253

［6］中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案〔J〕.中华传染病杂志，2001，19(1):56

［7］Huy TT，Ushijima H，Win KM，et al.High prevalence of hepatitis B virus pre-s mutant in countries where it is endemic and its relationship with genotype and chronicity〔J〕.J Clin Microbiol，2003，41(12):5449

［8］王国棠，田庚善.乙型肝炎病毒S/S基因变异及临床意义〔J〕.中华内科杂志，1994，33(4):264

［9］Hsieh Y，Su I，Wang H，et al.Hepatitis B virus pre-S2 mutant surface antigen induces degradation of cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1 through c-Jun activation domain-binding protein 1〔J〕.Molecular Cancer Research，2007，5(10):1063.

［10］Wang H，Huang W，Lai M，Su I.Hepatitis B virus pre S mutants，endoplasmic reticulum stress and hepatocarcinogenesis〔J〕.Cancer Science，2006，97(8):683