奶牛乳房内灌注头孢噻呋钠的消除动力学研究

严 凤，顾 欣，李丹妮，张文刚，蒋 音，张 鑫

(上海兽药饲料检测所，上海 201103)

头孢噻呋(Ceftiofur)是美国普强公司于20世纪80年代开发成功的兽医专用第三代头孢菌素类药物，其抗菌谱广，抗菌活性强，对革兰氏阳性菌、阴性菌及一些厌氧菌都有很强的抗菌活性，用于肉牛、奶牛、马、猪、羊的呼吸道疾病治疗［1-2］。随着头孢噻呋在畜牧业中的广泛使用，不可避免地引起其在动物组织或其产品中的残留。欧盟2002年4月颁布了关于头孢噻呋在组织中的最大残留量(MRL)，在牛奶中的 MRL 为100 μg/kg［3］。头孢噻呋只被批准注射用，然而，头孢噻呋偶尔会被用于乳房内注入治疗牛大肠菌群乳腺炎，这种用法会导致残留超出限量，并已导致数起牛奶残留超标［4］。头孢噻呋作为乳房内注入剂使用，还没有相应的残留数据来制定合适的休药期(也称弃奶期)推荐给执业兽医师。因此，本实验通过对泌乳期奶牛乳房内灌注头孢噻呋药物，对其在牛奶中消除动力学进行初步研究，为制定休药期给予参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品 头孢噻呋钠，注射液规格1.0 g(以头孢噻呋计)，批号091001，河北远征制药有限公司。

1.1.2 实验动物 3头健康荷斯坦奶牛。饲养记录分析显示奶牛在当前泌乳期内没有使用抗菌药物治疗过。在试验期间，奶牛正常饲养。

1.1.3 标准品与试剂 头孢噻呋标准品(纯度99%，Sigma公司)，二硫赤藓糖醇(纯度 99%，Sigma公司)，碘乙酰胺(纯度 98%，Sigma公司)。乙腈为色谱纯(Merck)，其他试剂为分析纯，水由MilliQ净化系统(Millipore公司)制得。头孢噻呋储备液(1 mg/mL):称取10 mg头孢噻呋标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-20℃保存，有效期为6个月。0.05 mol/L硼酸缓冲液:称取19 g硼酸和3.7 g氯化钾溶于900 mL水中，调节pH至9.0，用水定容到1 L。0.025 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0):将3.5 g磷酸二氢钠溶于 900 mL 水中，调节pH值至 7.0，用水定容至1 L。0.4%DTE 提取液(W/V):称取1.0 g二硫赤藓糖醇，溶于250 mL 0.05 mol/L硼酸缓冲液中(现配现用)。14%碘乙酰胺溶液(W/V):称取7.0 g碘乙酰胺，溶于 50 mL 0.025 mol/L磷酸缓冲液中(现配现用)。25%磷酸溶液:取25 mL磷酸，加水溶解并稀释至100 mL。

1.1.4 仪器与设备 超高效液相色谱仪(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)，Waters公司;串联四极杆质谱仪(Quattro Premier XE)，Waters公司;旋转蒸发仪(Laboroto 4000)，德国Heidolph公司;Oasis HLB(60 mg/3 cc)，Waters公司。

1.2 试验方法 每头奶牛有一个乳区不注入头孢噻呋钠，为空白对照乳区，其余三个为用药区。在试验正式开始前，收集基础(空白)牛奶样品，每个乳房用药量为0.3 g(以头孢噻呋计)，注入每头奶牛的乳房。大约8 h后，再次注入0.3 g(以头孢噻呋计)至奶牛的乳房。每8 h(在泌乳时)从每头牛的4个乳腺收集初乳样品(50 mL)，共6 d。牛奶样品收集后立即冰冻，在-20℃保存至分析。研究结束后，奶牛按计划结束产奶，或从牛群中淘汰。此研究中任何奶牛在当前用药期间内所产牛奶不得销售。

1.3 头孢噻呋及其代谢物的检测方法

1.3.1 提取与衍生 取1.0 mL牛奶于50 mL离心管中，加入11 mL 0.4%DTE提取液，混匀，于50℃恒温箱中保温15 min。加入3 mL 14%碘乙酰胺溶液，摇匀，室温下静置衍生30 min。用25%的磷酸溶液调节pH 至2.5～2.6，离心15 min(4℃，10 000 r/min)。

1.3.2 净化 依次用10 mL甲醇、10 mL水活化HLB萃取柱，取5 mL上清液过柱，流速为1 mL/min，用4 mL水淋洗小柱之后，用5 mL 90%乙腈溶液洗脱，洗脱液于60℃旋转蒸干，残余物用1 mL 0.2%的甲酸溶液复溶，过 0.22 μm 滤膜，供测定。

1.3.3 LC-MS/MS分析 色谱条件:色谱柱为Waters BEH C18，100 mm × 2.1mm(I.D.)，1.7 μm，柱温40℃;流动相为乙腈 -水(12∶88)，流速0.2 mL/min，进样量 10 μL。质谱条件:采用 ESI正离子多反应监测(MRM)模式;毛细管电压3.00 kV;锥孔电压25 V;离子源温度120℃;脱溶剂温度380℃;脱溶剂气流速700 L/h。定性离子对 m/z 487.0＞241.0的碰撞能量为15 eV;定量离子对m/z 487.0＞210.0的碰撞能量为20 eV。

2 结果

2.1 方法学 在添加浓度10～500 ng/mL范围内，峰面积(y)与质量浓度(x)呈良好的线性关系，其线性方程为y=11.29x-36.20，相关系数 r=0.9990，r2=0.9980。检测限 (LOD)和定量限(LOQ)分别为4 ng/mL和10 ng/mL，低于牛奶中头孢噻呋的残留限量。牛奶中添加10、50、500 ng/mL三个浓度，加标平均回收率为97.42% ～108.78%。

图1 3头泌乳期奶牛的3个乳腺区进行头孢噻呋乳内注入用药后(300 mg，间隔8 h，2次用药)牛奶中头孢噻呋消除的平均值

2.2 消除动力学 乳房内给予头孢噻呋药物，最初可引起牛奶中头孢噻呋的高浓度 107.89 μg/mL，牛奶中药物达峰时间为8 h。在乳房内用药后的最初56 h内，头孢噻呋浓度快速下降(图1)。当浓度下降到约0.2 μg/mL以下时(大约在最后一次用药后的64h)，头孢噻呋的消除速度开始缓慢。最后一次给药88 h后，所有乳腺中头孢噻呋的浓度都低于允许限量(0.1 μg/mL)(表1)，最后一次给药120 h后所有牛奶样品中头孢噻呋浓度都低于定量限。

表1 对3头泌乳期奶牛3个乳腺进行头孢噻呋钠乳内注入用药(300 mg，间隔8 h，2次用药)后头孢噻呋浓度超出允许限量(0.1μg/mL)的牛奶样品数

3 讨论

用药后，头孢噻呋快速代谢为脱呋喃甲酸头孢噻呋(desfuroyleceftiofur，DFC)和呋喃甲酸(furoic acid)。DFC进一步代谢为二硫化物类，如去呋喃甲酰头孢噻呋半胱氨酸二硫化物。游离的DFC含有一个完整的β-内酰胺环，它是具有微生物学生理活性的头孢噻呋代谢物。因此，检测牛奶中头孢噻呋残留的分析，也要能检测DFC和它的其他二硫化物代谢物。本文所用的UPLC-MS/MS方法，头孢噻呋和其他所有含完整β-内酰胺环的代谢产物通过使用二硫赤藓糖醇先转化为DFC。在还原状态下，溶液中过量的二硫赤藓糖醇维持着DFC上的巯基基团，同时与碘乙酰胺反应生成乙酰胺脱呋喃甲酸头孢噻呋(desfuroyleceftiofur-acetamide，DCA)。这样，单次的UPLC-MS/MS分析就能同时检测奶牛的生鲜牛乳中头孢噻呋及多种代谢物。

尽管牛奶中头孢噻呋浓度相当迅速地下降，但在最后一次给予头孢噻呋药物后，需要88 h(3.66 d)才能使所有牛奶样品中头孢噻呋浓度低于允许限量。研究中有3头奶牛三个乳腺的牛奶中头孢噻呋残留浓度低于允许限量，都需要80 h(3.33 d)至88 h(3.66 d)。研究结果表明，头孢噻呋乳内注入药物治疗乳牛的乳腺炎，可引起抗菌药物残留超出FDA对头孢噻呋的允许限量。基于上述研究结果初步建议，头孢噻呋在牛奶中的休药期(弃奶期)为4 d。

［1］Matthias Becker，Erhard Zittlau，Michael Petz.Quantitative Determination of Ceftiofur-related Residues in Bovine Raw Milk by LC-MS/MS with Electrospray Ionization［J］.Eur Food Res Technol，2003，(217):449-456.

［2］丁焕中，陈杖榴.兽用抗生素头孢噻呋的研究进展［J］.中兽医医药杂志，2000，(4):17-21.

［3］郝智慧，刘 力，冯淇辉.动物性食品中头孢噻呋残留检测研究［J］.药物检测，2004，21(4):26-27.

［4］Geof W Smith，Ronette Gehring，Jim E Riviere，et al.Elimination Kinetics of Ceftiofur Hydrochloride after Intramammary Administration in Lactating Dairy Cows［J］.Journal of the American Veterinary Medical Association，2004，224(11):1827-1830.