猪源分离大肠埃希菌产ESBLs的基因型及耐药性分析

刘雅妮，商 军，郭士博

(1.上海市兽药饲料检测所，上海 201103;2.南京农业大学动物医学院，南京 210095)

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是由质粒编码的，能通过结合、转化和转导形式，造成耐药基因在细菌间扩散，使敏感菌变成耐药菌;且产生ESBLs菌耐药谱广，表现为多重耐药，是临床常见的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌主要耐药机制［1-2］。随着兽医临床上抗菌药物的广泛应用，大肠埃希菌耐药菌株不断出现，甚至对多种抗菌药物同时耐药的多重耐药菌株也屡见不鲜，细菌耐药性的出现和耐药细菌的感染常使经验性治疗难以奏效，给兽医临床抗感染治疗带来极大的挑战。近年来，由于超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)造成部分β-内酰胺类抗菌药物临床失效的情况日益严重，对动物和人类的健康造成严重威胁，而大肠埃希菌是表示抗菌药物耐药性水平的一种指示菌［3-5］，因此有必要对大肠埃希菌的耐药性和ESBLs基因进行分析和研究。为了解大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶的检出率及其耐药性，指导兽医临床合理用药，对2010年9月-2011年3月从上海地区10个规模化养猪场分离得到的296株大肠埃希菌进行了研究分析。

1 材料与方法

1.1 材料 菌株，大肠埃希菌，2010年9月-2011年3月从上海地区10个规模化养猪场肛门样本中分离得到;质控菌株，大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，美国标准菌种保藏中心;7000荧光PCR扩增仪，美国AB公司;Taqman Mix PCR反应液、引物和探针，上海英骏公司;低温离心机，德国Beckman公司;VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统及配套细菌鉴定卡(GN卡)，法国生物梅里埃公司;普通营养肉汤、营养琼脂，北京陆桥技术有限责任公司;麦康凯琼脂，美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 采样 以灭菌棉签拭子采猪肛门作为大肠埃希菌分离，每个养殖场采30～60份拭子样本，共320份样本。

1.2.2 菌株分离、纯化与鉴定 取拭子样品用接种棒直接接种于麦康凯琼脂平面，37℃培养18～24 h，挑取粉红色、边缘光滑的大肠埃希菌可疑菌落，用麦康凯培养基纯化一代，然后接种于营养琼脂平面，37℃培养12～24 h。采用生物梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统鉴定出296株，分离率为92.5%。

1.2.3 ESBLs确证试验 采用微量肉汤稀释法，用头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟三种抗生素进行初筛试验。以头孢他啶、头孢他啶+克拉维酸和头孢噻肟、头孢噻肟+克拉维酸这两种组合进行确证试验。结果判读参照美国全国临床检验标准委员会(CLSI M100-S20)推荐的ESBLs表型确证试验法筛选出产ESBLs大肠埃希菌52株［6］。

1.2.4 药敏试验 采用微量肉汤稀释法，对52株产ESBLs和244株非产ESBLs大肠埃希菌进行5类10种常见兽用抗菌药物药敏试验。按农业部发布的《抗菌药敏感性试验操作方法和判断标准》和CLSI M100-S20标准判断药敏结果［6］。

1.2.5 实时荧光PCR扩增 (1)引物设计。分别根据ESBLs的SHV、TEM、CTX-M、OXA编码基因序列设计引物和探针，所有引物由上海英骏合成(表1);(2)菌液的DNA模板制备。采用传统的煮沸法提取质粒DNA［7］，挑取新鲜单个菌落溶于100 μL 双蒸水，煮沸 15 min，10000 r/min，离心 5 min，吸取上清液作为模板液备用;(3)阳性标准菌株制备。将定性PCR扩增出的SHV、TEM、CTX-M、OXA全长序列产物与pMD18-T载体连接，DH5α大肠埃希菌进行转化;(4)PCR反应体系。Platinum Super Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，终浓度为 0.4 μmol/L，Taq Man 探 针 0.3 μL，终 浓 度 为0.24 μmol/L，模板1 μL，双蒸水补至25 μL;(5)PCR 反应参数。试验采用两步法进行。50℃，2 min，激活UNG酶;94℃预变性2 min，激活金牌Taq Man酶，94℃变性30 s，60℃退火1 min，40个循环，所有检测荧光扩增曲线由7000检测系统自动生成;(6)扩增产物的克隆及测序。将上述PCR扩增产物回收，克隆测序，并与NCBI基因库进行序列比较。

表1 ESBLs四种基因型荧光PCR引物和探针的设计

2 结果

2.1 ESBLs的筛选和药敏试验结果 按1.2.3 ESBLs确证试验，采用微量肉汤稀释法，从296株大肠埃希菌中筛选出52株产ESBLs大肠埃希菌，分离率为17.6%。按1.2.4药敏试验，对52株产ESBLs和244株非产ESBLs大肠埃希菌进行10种抗菌药物的药敏试验，试验结果如表2、图1所示。试验结果表明，产ESBLs的大肠埃希菌的耐药率明显高于非产ESBLs的大肠埃希菌，且产ESBLs大肠埃希菌组表现为多重耐药性。耐药率在90%以上的有氨苄西林、头孢唑啉和诺氟沙星;70%以上的为复方新诺明和氟苯尼考;60%以上的为头孢噻呋和卡那霉素;50%以上的为奥格门丁(阿莫西林/克拉维酸)、庆大霉素和达氟沙星。对10种抗菌药物表现出不同程度的多重耐药性，主要为7重～10重耐药。值得关注的是，对头孢噻呋和诺氟沙星耐药率，产ESBLs大肠埃希菌显著性地高于非产ESBLs大肠埃希菌。

表2 52株产ESBLs大肠埃希菌和244株非产ESBLs大肠埃希菌药敏试验比较结果

图1 52株产ESBLs大肠埃希菌和244株非产ESBLs

2.2 产ESBLs大肠埃希菌基因型检测结果 按1.2.5实时荧光PCR扩增，通过设计四对特异性引物和探针对每株细菌进行了PCR扩增，对确证的52株产ESBLs大肠埃希菌进行基因分型试验，结果如表3、图2所示。试验结果表明，52株细菌中46株携带TEM型的基因，占总数的88.5%;15株细菌携带CTX-M型基因，占总数的28.8%;11株细菌同时携带TEM型和CTX-M型基因，占总数的21.2%;未检出携带 SHV型、OXA型的菌株;2株未检测到上述四种基因型，可能还存在其他基因型，有待于进一步的研究。

表3 产ESBLs大肠埃希菌PCR扩增产物检测结果

图2 TEM基因型和CTX-M基因型ESBLs的PCR反应曲线

3 讨论

在分离的296株猪源大肠埃希菌中产ESBLs检出率为17.6%，对10种抗菌药物药敏试验中，与非产ESBLs大肠埃希菌相比，产ESBLs大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢噻呋、庆大霉素、诺氟沙星和达氟沙星呈现更高的耐药性，对动物专用药物第三代头孢菌素头孢噻呋的耐药率为63.5%，且对10种抗菌药物表现出不同程度的多重耐药性，主要为7重～10重耐药，占88.5%。

在对52株产ESBLs大肠埃希菌基因型分析中，检出携带TEM型、CTX-M型和TEM+CTX-M型ESBLs耐药基因，没有检出携带SHV型、OXA型和TEM型+SHV型ESBLs耐药基因，提示这可能与上海地区规模化猪场使用头孢菌素类药物的种类和频率有关，且规模化猪场产生ESBLs的大肠埃希氏菌未通过质粒进行细菌间耐药基因的交换。

由于抗生素选择性压力的不断增大，人医临床新的超广谱β-内酰胺酶不断涌现［8-9］，抑制细菌β-内酰胺酶活性是克服该类细菌耐药性的有效手段。为防止产ESBLs菌的克隆性传播，畜禽养殖场应制定有效的消毒隔离措施，并结合药敏结果，合理应用抗生素，尤其是第三代头孢菌素，延缓耐药菌株的产生，轮换使用抗生素，对控制产ESBLs菌株的感染将起到十分重要的作用。

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