灰黄霉素在家兔组织中的分布及残留消除规律研究

高淑霞，姜文学，杨丽萍

(山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100)

灰黄霉素(Griseofulvin)是灰黄霉素青霉菌的代谢产物，其化学名称为6’-甲基-2’，4，6-三甲氧基-7-氯-螺［苯并呋喃-2(3H)，1’-［2］环己烯］-3，4-二酮。灰黄霉素是一种抗真菌抗生素，主要用于治疗皮肤真菌病，对毛发癣菌、小孢子菌、表皮癣菌等浅部真菌有良好抗菌作用。报道表明，灰黄霉素用于预防和治疗家兔皮肤真菌病有一定效果［1］。

据报道有人服用灰黄霉素产生毒副作用的病例。胡建佳等［2］报道了应用大剂量灰黄霉素后发生的6例恶性肿瘤，患者都是因为治疗癣病而长时间服用大剂量的灰黄霉素，而且无其他致癌因素可追溯。Rosa F W等［3］报道，部分在妊娠头3个月服用灰黄霉素的孕妇分娩出有缺陷的胎儿。张孟霞［4］报道了一例由于长期大量服用灰黄霉素而诱发的迟发性皮肤卟啉症。

目前动物性食品安全备受关注。灰黄霉素在家兔生产中时有应用，但未见家兔服用灰黄霉素后的组织分布及残留情况相关文献报道。本文的目的是研究家兔服用灰黄霉素后的组织分布及残留情况，为灰黄霉素用于治疗家兔真菌病的安全性评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备 Agilent 1200系列液相色谱系统;G1329A柱温箱、G1311A自动进样器、G1322A泵;Agilent 6410三重串联四级杆质谱仪;XW-80A漩涡混合仪;Milli-Q超纯水系统;TG16-WS台式高速离心机;METTLER AB265-S电子天平;H1850台式高速冷冻离心机;海尔DW-86L386超低温冰箱。

1.2 主要试剂 灰黄霉素供试品(武汉远成共创科技有限公司，批号091147，含量≥95%);灰黄霉素对照品(AlfaAesar，批号G8629A，含量97%);盐酸普萘洛尔内标物(AlfaAesar，批号H26645，含量99%);甲醇、乙腈、乙酸均为色谱纯;二氯甲烷为分析纯。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 灰黄霉素标准溶液 精密称取灰黄霉素(97%)5.12 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容，摇匀，配成浓度为497 μg/mL的灰黄霉素储备液I。使用时，取储备液I用甲醇逐级稀释为2490、1030、651.25、518.7、259.4、129.7、32.4、10.8 ng/mL的标准工作液。

1.3.2 盐酸普萘洛尔内标标准溶液 精密称取盐酸普萘洛尔(99%)3.93 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容，摇匀，配成浓度为389 μg/mL的盐酸普萘洛尔储备液II。使用时，取储备液II用甲醇稀释为116.7 ng/mL的内标标准工作液。

1.4 液相色谱条件 流动相为乙腈 ∶水(0.1%乙酸)=65∶35(V∶V);流速 0.4 mL/min;色谱柱:ZORBAX SB-C18预柱(4.6 mm ×12.5 mm，5 μm)，ZORBAX RX-C18色谱柱(2.1 mm × 150 mm，5 μm);柱温 30℃;进样量 2 μL;采样时间 3 min。

1.5 质谱条件 采用多反应监测(MRM)扫描模式进行分析检测。Agilent 6410串联四极杆质谱仪，配置了ESI离子源。在ESI(+)模式下，采集数据。设定质谱参数如下:Capillary 4000 V，Drying Gas 10.0 L/min。Neb Press 40.0 psi。Gas Temp 350 ℃，Fragmentor 135，Skimmer 15，Oct DC1(Skim2)45 V，0ct RF 500 V，碰撞气为氦气，Q1 和Q3的分辨率均为单位质量分辨。MRM模式下灰黄霉素与盐酸普萘洛尔的定量分析离子对参数分别为353.0→165和260→116，碰撞能量均为20 V。

1.6 组织中灰黄霉素提取方法 称取一定量的肌肉、肾脏、肝脏、皮肤和脑组织样品，研磨后冻存于-50℃冰箱中;检测时室温条件下解冻后，加入116.7 ng/mL的盐酸普萘洛尔10 μL，再加入5 mL二氯甲烷，快速涡旋提取约1min，样品于3 000 r/min离心10 min后，取4 mL 下层有机相0.22 μm针头式过滤器过滤于10 mL离心管中，氮气吹干后100 μL甲醇涡旋复溶后(脑组织氮气吹干后加入1 mL甲醇涡旋复溶后，液体转移至1.5 mL塑料离心管中，12 000 r/min离心10 min后，转移至另一离心管中，氮气吹干后，加入100 μL甲醇涡旋复溶)，液体转移至1.5 mL塑料离心管中，12 000 r/min离心10 min后，移入棕色瓶中，进样分析。

1.7 标准曲线的绘制 取空白组织匀浆，分别加入甲醇和不同浓度的灰黄霉素标准工作液，使组织液中的药物浓度为 0、1.08、3.24、12.97、25.94、51.87、65.125、103、249 ng/mL，再分别加入 116.7 ng/mL的盐酸普萘洛尔10 μL和5 mL二氯甲烷，按1.6项下方法处理并进样分析。以分析仪响应峰面积(Y)对灰黄霉素浓度(X)做线性回归。

1.8 定量限的测定 取空白组织匀浆，分别加入各低浓度灰黄霉素标准工作液，再分别加入116.7 ng/mL的盐酸普萘洛尔10 μL和5 mL二氯甲烷，按1.6项下方法处理并进样分析。以最低测得浓度计算，在信噪比(S/N)为10时，定为定量限。

1.9 回收率的测定和精密度试验 各空白组织中分别添加低、中、高三个药物浓度，每一浓度5个平行样品，于当日和连续3 d测定，计算日内和日间精密度。以测得样本的峰面积与相应浓度的标准溶液峰面积对比，计算方法回收率。

1.10 实验方法 选用42只体重2 kg左右、健康的新西兰白兔，饲料中加入灰黄霉素(800 g/1 000 kg)进行饲喂，自由采食、饮水，连续饲喂14 d。同时选用6只新西兰白兔饲喂常规饲料，作为空白对照。分别于停药后第1、3、5、7、9、14、21 天，随机宰杀6只，取肌肉、肝脏、肾、脑和皮肤组织样品，所取样本不进行任何洗涤或处理，随即对各组织分别包装、贴签、编号，-20℃以下条件保存待分析。并于停药后第1天同时取空白对照组织样品。

2 结果与分析

2.1 检测方法的有效性 肌肉、肾和肝组织中的灰黄霉素在1.08～249 ng/mL浓度范围内，脑、皮肤组织在1.08～51.87 ng/mL浓度范围内，仪器响应峰面积与浓度呈线性相关，相关系数(r2)均大于0.99。各组织的定量限均为1.08 ng/mL。各组织的药物添加回收率为81% ～94%，日内变异系数为4.23% ～12.4%，日间变异系数为 4.46% ～14.01%。该方法的添加回收率和变异系数符合生物样品中的药物检测要求［5］，可用于家兔组织中灰黄霉素的检测。

2.2 检测结果

2.2.1 灰黄霉素在家兔组织中的分布及残留浓度连续用药14 d后，停药第1天进行屠宰、取样、检测。检测结果显示，除脑组织外，灰黄霉素在各组织中均有分布，肝组织中的浓度最高，为134.61 μg/kg;肾组织浓度较高，为 54.09 μg/kg;脑组织浓度最低，其检测值低于定量限。灰黄霉素在家兔组织中的分布及残留浓度如表1所示。

表1 不同停药期灰黄霉素在家兔组织中的分布及残留浓度(μg/kg)

2.2.2 灰黄霉素在家兔组织中的消除规律 结果表明，停止饲喂添加药物饲料后，随着时间的延长，灰黄霉素在肌肉、肝、肾和皮肤组织中的浓度逐渐下降，且在肝中的消除最快(图1)。停药21 d后，肝、肾组织中仍可检测到灰黄霉素残留，灰黄霉素在肾组织中浓度为3.39 μg/kg，在肝组织中浓度为12.36 μg/kg，其他组织未检出。

图1 灰黄霉素在兔各组织中的残留消除曲线

3 小结

连续用药14 d后，灰黄霉素在家兔组织中的分布情况为肝＞肾＞肌肉＞皮肤＞脑组织;停药后，灰黄霉素在各组织中的浓度均呈下降趋势(脑中未检出)，且在肝中的消除最快;停药21 d后，肝、肾组织中仍可检测到灰黄霉素残留。

在家兔生产中，少数养殖场(户)采用灰黄霉素对家兔皮肤真菌病进行治疗。一方面，灰黄霉素不能随意作为兽药使用;另一方面，根据文献报道灰黄霉素有毒副作用，用于食品动物后，产品中的残留对人体的危害尚未知。因此，在目前的家兔生产中应慎用灰黄霉素。

［1］王耀先.灰黄霉素片治兔体表真菌病效果好［J］.中国养兔杂志，2004，6:34-35.

［2］胡建佳，朱永福，张中一.应用大剂量灰黄霉素后发生恶性肿瘤6 例报告［J］.癌症，1986，1:115-116.

［3］Rosa F W，Hernandez C，Carlo W A.Griseofulvin Teratology，Including Two Thoracopagus Conjoined Twins［J］.Lancet，1987，1(8525):171.

［4］张孟霞.灰黄霉素诱发迟发性皮肤卟啉症一例报告［J］.湖南医学院学报，1984，9(3):315.

［5］ 操继跃，卢笑丛.兽医药物动力学［M］.北京:中国农业出版社，2005:176-217.