不同毒力疟原虫感染早期根治性治疗对再感染细胞免疫应答的影响

刘英杰,潘艳艳,李 莹,冯 辉,刘 军,曹雅明

2.中国医科大学免疫学教研室,沈阳 110001

疟疾流行主要由恶性疟原虫和间日疟原虫感染所致,但两个虫种的毒力存在明显差异,其中前者毒力较强,是导致重症疟疾发生的主要虫种。疟疾再感染的发生在流行区普遍存在,但恶性疟再感染的发生风险显著高于间日疟[1],表明原虫毒力差异与再感染的免疫保护存在密切相关性。细胞免疫应答是抵御胞内寄生病原体再感染的主要因素[2],然而毒力不同的疟原虫感染早期根治性治疗后,宿主在再感染过程中细胞免疫应答是否存在差异,目前尚未见明确报道。

致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii17XL,Py17XL)和非致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii17XNL,Py17XNL)分别与恶性疟原虫和间日疟原虫具有相似的生物学特性[3]。为此,我们对Py17XL和Py17XNL感染早期DBA/2小鼠进行根治性治疗,然后用同种疟原虫进行再感染,通过对再感染前后细胞免疫应答强度的检测,探讨了毒力不同疟原虫感染早期的根治性治疗对再感染细胞免疫应答的影响。

1 材料与方法

1.1 小鼠、疟原虫和实验感染 雌性,6～8 w龄DBA/2小鼠,分别经腹腔接种1×106Py17XL和Py17XNL寄生的红细胞。尾静脉采血,吉姆萨薄血膜染色法计数红细胞感染率。

1.2 药物治疗和小鼠再感染 初次感染后3 d,经口给药(氯喹90 mg/kg,青蒿琥脂片60 mg/kg),每天一次,连续3 d。待初次感染后90 d,小鼠用同种疟原虫再次攻击感染。

1.3 脾细胞培养 无菌取出再感染前(0 d)和再感染后第1、3、5 d小鼠脾脏,常规制备脾细胞悬液,调脾细胞终浓度为1×107/mL,于24孔培养板上加入细胞悬液,500 μ L/孔,一式 3 组 ,培养 48 h,收集上清,-80℃保存,待细胞因子检测。

1.4 脾T细胞中活化性T细胞百分率的检测 在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的染色管中加入脾细胞悬液0.1 mL,再加入抗CD4-FITC和抗CD69-PE mAb进行表面染色,洗涤两次并悬于500 μ L PBS中,流式细胞仪检测。

1.5 细胞因子检测 用ELISA试剂盒按说明书的实验步骤对小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的含量进行检测,酶标仪检测450 nm处OD值。以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线,计算细胞因子含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS11.5统计学分析软件,Student′s-t检验比较各组均值的显著性差异,P＜0.05为差异有统计学意义(结果为3次结果的均值)。

2 结 果

2.1 再感染后不同时间的原虫血症水平 如图1所示,两组感染早期根治性治疗小鼠在再感染过程中均出现了短暂的低水平虫体血症。在再感染后每一检测时间点,不同毒力虫株感染鼠的虫体血症水平基本相似,并均于攻击后第6 d左右自愈;而未治疗初次感染小鼠的虫体血症水平持续升高,表明毒力不同疟原虫初次感染早期根治性治疗的小鼠对同种疟原虫的再感染具有相似的抵抗力。

图1 Py17XL和Py17XNL初次感染和再感染后的虫体血症水平Fig.1 The levels of parasitemia after primary infection and reinfection with Py17XL and Py17XNL

2.2 再感染前后不同时间点脾T细胞中活化性T细胞的百分率 如图2所示,与正常或再感染前小鼠相比,再感染后第1 d两组小鼠脾T细胞中活化性T细胞百分率均明显增加,表明再感染前小鼠体内存在一定数量的记忆性T细胞,当再次感染时这些细胞迅速活化。而此后其进一步升高,则提示除记忆性T细胞活化外,可能又有一些初始T细胞逐渐活化。但在每一检测时间点,不同毒力虫株感染鼠活化性T细胞的百分率基本相似。

2.3 再感染前后不同时间点脾细胞培养上清中Th1型细胞因子水平 如图3所示,与正常或再感染前小鼠相比,再感染后第1 d两组小鼠的IFN-γ水平均出现了有意义的升高,并于第3 d达到峰值水平;与此同时,TNF-α也开始显著升高。在每一检测时间点,不同毒力虫株感染鼠间的IFN-γ和TNF-α水平没有显著差异。

2.4 再感染前后不同时间点脾细胞培养上清中Th2型细胞因子水平 如图4所示,与正常或再感染前小鼠相比,两组小鼠的IL-4和IL-10分别在再感染后第5 d和3 d出现了有意义的升高。尽管IL-10在再感染后第5 d出现一定程度的下降,但在每一检测时间点,不同毒力虫株感染鼠间的IL-4和IL-10水平并没有显著差异。

3 讨 论

流行病学调查显示,恶性疟再感染的发生风险高于间日疟[1],尽管恶性疟再感染后的虫荷水平有所下降,但多数感染者仍具有较高的虫荷水平,并有明显的发热等临床表现[4],而间日疟再感染后的虫荷水平较低,且没有明显的临床症状[5]。有研究证实,CD4+T细胞介导的细胞免疫在抵御疟疾再感染过程中发挥重要作用[6],间日疟感染者痊愈后一年左右,其外周血中淋巴细胞可对间日疟原虫抗原产生明显的应答反应(分泌高水平IFN-γ),但恶性疟感染者却未能产生此应答反应[7]。这些结果充分提示,再感染的T细胞应答水平与原虫毒力差异存在密切相关性。

本实验结果显示,不同毒力虫株感染鼠早期根治性治疗后对同种疟原虫再感染具有相似的抵抗力;其再感染后均可迅速建立以IFN-γ分泌升高为主的高强度Th1应答,而后又产生了适度的以IL-4和IL-10升高为主的Th2应答,并且在每一相同检测时间点,不同毒力虫株感染鼠间无论是虫体血症水平还是活化性T百分率以及Th1和Th2细胞因子水平均未出现显著差异。有研究证明,强毒株疟原虫感染可损伤或破坏宿主的免疫器官,进而产生免疫抑制效应[3];抗原剂量可改变宿主的免疫应答类型和强度[8-9]。据此我们认为,当 Py17XL和Py17XNL感染的红细胞在外周血出现时即进行根治性治疗可使小鼠受到相同的虫荷抗原刺激,同时也抑制了强毒株Py17XL对小鼠免疫系统的破坏作用,因此两组小鼠在再感染时获得了相似的免疫保护。

综上所述,不同毒力疟原虫感染早期根治性治疗后,宿主在同种疟原虫再感染时可产生模式和强度相似的细胞免疫应答,强毒株原虫感染也能获得与弱毒株相同的可抵御再感染的能力。

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