猪胸膜肺炎放线杆菌分子生物学研究进展*

吕素芳,郭广君,唐 娜,魏 凤,沈志强,2

2.山东绿都生物科技有限公司,滨州 256600

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)的致病菌,属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属。猪胸膜肺炎放线杆菌是一种革兰氏阴性杆菌,具有很高的致病性,由本菌引起的猪接触性传染性胸膜肺炎是猪的呼吸道传染病,各种年龄的猪均易感,本病在临床上常见,一旦发生感染则很难从猪场中根除。受感染的猪急性症状表现为具有高死亡率的纤维素性肺炎和胸膜炎,慢性症状表现为可造成动物生长缓慢的肺损伤,给世界各地的养猪业造成了重大的经济损失,己成为严重危害现代养猪业的重要传染病之一[1-2]。由于本病在急性期中有大量的鼻排泄物,所以有可能通过衣服、胶靴或仪器传播,应注意防护。对APP的病原学、血清型和流行特点的系统研究可以提高诊断和防控该病的水平。

1 血清型分类

APP的血清型较多,其血清型的划分是依据荚膜多糖和菌体脂多糖的抗原性不同来区分的,目前己鉴定出15种血清型[3],由于各血清型间的抗原性和病原性不尽相同,导致不同血清型间没有交叉保护力,从而增加了该病防治的难度。根据培养时是否需要NAD,可将其分为生物I型和生物II型[4-5],其中APP 1～12型和15型是典型的生物Ⅰ型。其中血清Ⅰ型被分成2个亚型即1A和1B,血清5型被分成2个亚型即5A和5B。APP-13型和APP-14型为生物Ⅱ型,分布于欧洲及美国。我国流行的血清型为 1、2、3、5、7、10 等型 ,以 1、3 、7 型为主[6-7]。主要血清型间缺乏很好的交叉免疫性。由于APP的血清型众多,各血清型间无交叉保护以及各地流行背景日益复杂致使该病难以控制,临床上急需多价、高效的疫苗预防和控制该病,因此对APP的检测和分型对防治至关重要。

2 毒力因子

胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子有很多,其中主要包括溶血素(Apx)、荚膜多糖(Capsularpolysaccharide,CP)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)、转铁结合蛋白(T ransferrin binding protein,Tbp)、蛋白酶(Protease)、渗透因子(permeate factor,PF)、黏附素等[8-9]。这些毒力因子都能引起胸膜肺炎的发生,其中溶血毒素、荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白在胸膜肺炎发生过程中扮演着更为重要的角色,也是主要的免疫原性物质。

2.1 溶血毒素(Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxin,Apx) 毒素是APP主要的毒力因子,属于RTX毒素(repeats in toxin)家族,在所有的15个App血清型中共分泌 4种 Apx毒素,分别为ApxⅠ 、ApxⅡ 、ApxⅢ和ApxⅣ。前3种Apx毒素既是App致病的主要毒力因子,又是App主要的保护性抗原[10],对于疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的。不溶血的突变株不能对动物产生保护力,不产毒素的菌株只能对其相应血清型的感染产生保护,而不能对其他血清型的感染产生保护。不同的血清型分泌不同的毒力因子,对宿主产生不同的致病性,因此毒力因子及其基因与血清型存在着密切的关系。

2.1.1 ApxI 相对分子质量为105 ku,具有很强的溶血活性[11],对肺泡巨噬细胞和中性粒细胞也具有很强的细胞毒性作用,血清型1,5,9,10,11和14均能表达并分泌。有活性的ApxI受一个操纵子的调控,包括4个基因,即ApxI CABD。ApxIA基因编码毒素蛋白的前体,ApxIC基因编码毒素翻译后的激活物,ApxI BD基因的产物负责毒素的分泌。在血清型1,5a,5b,9,10和11中,存在完整的ApxI的操纵子,它们产生具有强溶血和强细胞毒性的ApxI。这几种血清型也往往造成传染性胸膜肺炎的急性爆发。此毒力基因在几个血清型间均有交叉抗原性,可利用其高度的保守性对此类血清型APP进行正确诊断,特别是APP 10型菌只分泌ApxI而不分泌其他毒素,因此可利用ApxI作为诊断抗原,全面确诊该病有着重要的临床意义。严克霞等[12]利用毒性极强的APP21菌株表达的ApxIA毒素,与天然毒素进行免疫原性比较,结果复性的重组表达蛋白和天然毒素均具有较好的免疫原性,对小鼠产生较好的免疫保护。马艳芳[13]等研究毒素Apx l对小鼠的致病性及免疫原性,结果含ApxI的亚单位油乳剂疫苗抵抗异源血清型的APP攻击时可以起到一定的保护作用。Liu等[14]在血清7型活疫苗株HB04C-基础上,利用穿梭载体构建共表达Apx-IA基因的免疫原性增强的多价弱毒APP疫苗株HB04C2,来预防猪的呼吸系统疾病。对其进行生物学特性研究,发现穿梭载体携带的ApxIA基因在疫苗株HB04C2里稳定表达,且不影响疫苗株的生长能力。作为活疫苗对猪进行气管内给药,可以产生抵抗ApxIA和ApxIIA毒素的抗体,所有免疫猪均可以抵抗来自不同血清1型APP流行株的攻击。结果表明,APP活疫苗株可以作为载体来表达不同的抗原。Zou H等[15]进行了APP血清10型弱毒株apxIC-/P36+的构建与分析研究,结果与亲本株比较,体外培养的缺失株具有同样的生长效率且在老鼠体内毒力减弱。动物实验表明,缺失apxIC基因的突变株能与亲本株一样成功诱导免疫反应。Chiang CH等[16]评价编码ApxIA或ApxIIA基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫反应和保护效率。对小鼠肌肉注射疫苗后成功诱导了较强的体液免疫反应,二价疫苗可同时诱导Th1和Th2免疫反应。利用APP血清1型进行攻毒保护试验,结果,pcDNA-apxIA疫苗组和pcDNA-apxIA/pcDNA-apxIIA二价疫苗组的保护效率显著高于阴性对照组,而pcDNA-apxIIA疫苗组只提供有效的保护效率,与对照组相比不明显,证明二价疫苗为最佳。DNA疫苗作为第3代疫苗为APP免疫提供新思路。

2.1.2 ApxⅡ 相对分子质量为105 ku,对肺泡巨噬细胞和中性粒细胞也具有细胞毒性作用,因此它也被称作clyⅡ(cytolysinⅡ)。ApxⅡ的操纵子与前者稍有不同,即ApxⅡCA操纵子和ApxⅠBD操纵子。除10和14型外,所有的血清型都可分泌此毒素。ApxⅡCA基因在所有的血清型中都非常保守,几乎没有变异。ApxⅡ毒素具有良好的免疫原性。王春来等[17]利用ApxⅡA基因构建原核表达载体,结果在BL21中一包涵体形式表达,经Western blot检测,产物具有良好的免疫原性,可以作为抗原用于ELISA诊断。李任峰等[18]利用生物信息学方法对AY232288.1菌株(湖北分离株)的ApxllA基因及其蛋白质结构进行了分析和预测,结果745-751和801-807氨基酸序列区段可能是B细胞表位优势区,为 ApxllA基因功能的深入研究及APP多表位疫苗的设计奠定了基础。贾凡等[19]研制的ApxⅡ-ELISA试剂盒能够有效的诊断猪传染性胸膜肺炎。同时也可作为一种评价猪群免疫后免疫效果的有效方法。

2.1.3 ApxⅢ 没有溶血活性,但其对肺泡巨噬细胞和中性粒细胞有很强的细胞毒性作用。ApxⅢ操纵子具有完整的ApxⅢCABD基因,编码120 ku的蛋白。其中ApxⅢA基因编码毒素的结构蛋白,ApxⅢBD基因具有高度同源性。ApxⅢ毒素存在于血清型2,3,4,6,8,15中,其中3型只能分泌ApxⅢ毒素,故毒力较弱。邵美丽等[20]以APP-2型参考株基因组为模板,扩增出ApxⅢA基因3.1 kb的片段,构建原核表达载体并获表达,Western blot证明融合蛋白具免疫学活性。

2.1.4 ApxⅣ 是近几年才发现的一种毒素,相对分子质量为202 ku。APP所有血清型在体内均可分泌ApxⅣ,该毒素毒力很弱,只有在动物体内才会被诱导表达,在任何培养基上均不表达。这是APP中迄今发现的惟一一个只在体内表达的基因。ApxⅣ的种间特异性很强,是APP中特异的毒素蛋白,不与其他亲缘关系较近的种属的抗血清发生交叉反应,是良好的诊断试剂抗原[21]。国内,许多学者利用PCR技术扩增ApxⅣ基因的片段或全序列,已取得比较满意的效果。Dreyfus等[22]用ApxⅣ基因的原核表达蛋白,进行免疫印记法检测APP感染情况,结果灵敏度达100%,用该蛋白包被抗原制成ELISA试剂盒,可对感染后3 w的猪作出检测,同时可鉴别疫苗毒和野毒(differentiate infected from vaccinated animals,DIVA)。O'Neill C等[23]对英国地区APXIVA-DIVA方法进行分析总结。Apx IVA毒素是区别APP自然感染毒和疫苗毒的首选抗原,将ISApl1插入apxIVA基因是常用的建立ApxIVA-DIVA的方法,但在apxIVA基因内存在一个潜在的TGG到TGA的点突变。插入ISApl1后,除了两个血清3型分离株外,同样来自英国的其他血清2/3/6-8和12血清型均未发现突变,几率为18.1%。Liu J等[24]在apxIIC-缺失突变株的基础上获得apxIVA突变株,通过在猪体内感染试验来评价其毒力。记录了猪体的临床症状、肺脏损伤情况、血液的生化指标和组织病理学变化。结果表明,未缺失ApxIVA基因的APP菌株致病性更强,揭示ApxIVA基因是APP完全毒力必须基因。Wang C等[25]研究了rApxIVN在猪抵抗APP感染中的免疫保护作用。以(rApxIVN)Ⅰ组、(rApxI+rApxII+rApxIII+rApxIVN+rOMP)Ⅱ组、(rApxI+rApxII+rApxIII+rOMP)Ⅲ组和 PBS组,分别免疫猪,用血清1型分离株JMS 06和血清2型分离株FX 01攻毒。结果Ⅰ组和Ⅱ组均产生了较高的针对rApxIVN的抗体滴度。针对 rApxI,rApxII,rApxIII和rOMP的抗体滴度方面,Ⅱ组比Ⅲ组高。攻毒后,Ⅰ组免疫的猪表现了严重的呼吸症状和肺脏损伤,与对照组类似。Ⅱ组和Ⅲ组针对两个血清型均能提供保护,与Ⅲ组相比,Ⅱ组产生了轻微的肺损伤和发热感染。结果表明,rApxIVN作为抗原可以提供针对APP攻击的保护。Yang W等[26]建立了针对APP apxIVA基因的环介导等温扩增(LAMP)技术,对15株APP菌株和7株其他菌株进行扩增,与常规PCR比较,结果特异性相当,敏感性强10倍。临床应用显示,通过细菌分离试验、巣式PCR和LAMP对比,65份采自健康猪的样品结果均为阴性,115份采自有明显呼吸症状猪的样品结果,22份阳性。与巢式PCR相比,LAMP表现出更高的敏感性,是一种检测APP感染的可靠方法。

2.2 荚膜多糖(CPS) 荚膜的化学结构主要由重复单糖组成,荚膜多糖CPS结构是 App在猪体内合成和生长的重要成分。荚膜多糖决定App的血清型抵抗力和毒素强度方面的重要性。不同菌种间荚膜的毒力及免疫原性的差别可能与荚膜成分和结构有关,荚膜所表现的毒力与宿主防御系统与荚膜本身之间的相互作用机制有很大的关系。通常荚膜的结构、组成甚至厚度都可以影响到APP菌株的毒力[27]。一般来说,荚膜越厚毒性越强。Aloka B等[28]对荚膜多糖的3个开放阅读框cps1A,cps1B和cps1C进行研究,通过分子生物学手段获得不同的缺失菌株,研究产生CP的能力。结果表明不同种类荚膜多糖可能通过表达机制来影响其毒力。

2.3 脂多糖(LPS) 脂多糖的毒力主要是脂质A的作用。脂质A可以激发机体防御系统,最终导致组织损伤;另外,脂多糖还可增强溶血素对巨嗜细胞的毒性作用。相同的LPS的O-链表面抗原决定簇可以被多个不同的血清型同时拥有,如3、6、8型的O-链组成相似,1、9、11型的 O-链组成相似,4、7 型的O-链组成相似,这是血清型交叉反应的主要原因。LPS免疫原性很弱,刺激产生的LPS抗体,只能抵抗发病,不能抵抗感染,且具有血清型的特异性,只能对APP的攻击提供部分的保护。Tumamao等[29]的研究也表明这一点。

2.4 外膜蛋白(Omp) 具有免疫原性,其基因两端保守,具有种特异性,中间易变异,5′端保守区域约200 bp,3′端约100 bp,中间变异区约700 bp。根据中间变异区将App生物Ⅰ型分为4个群,1、9、11、12型为一群 ,3、4、6、7 型为一群,5、10 型为一群,2、8型为一群。杨建德等[30]通过基因组文库筛选获得外膜蛋白基因,克隆表达该外膜蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应,为最终建立APPELISA检测方法奠定了基础。邵美丽等[31]以APP血清7型25-4株DNA为模板,扩增OMP基因,构建原核表达载体pGEX-omp,纯化表达的蛋白,经ELISA检测,该蛋白与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。

2.5 转铁结合蛋白(Transferrin Binding Proteins,Tbp) APP的转铁结合蛋白有2种不同的蛋白构成,即转铁结合蛋白A(TbpA)和转铁结合蛋白B(TbpB),它们是功能性的转铁结合蛋白受体,而且特异性的针对猪转铁蛋白。近年来的研究表明,TbpA和 TbpB是APP的主要毒力因子,Baltes等[32]用缺失tbpA和tbpS的血清7型突变株感染动物,发现无任何临床症状,不能引起机体的体液免疫反应,从感染的猪的扁桃体、肺、淋巴结及心脏中分离不到细菌。研究发现转铁结合蛋白也具有一定的保护性,用60 kD的 Tbp2免疫的猪只能对相同血清型菌株的攻击可以提供部分保护。Overbeke等[33]发现当用Top与Apx混合免疫时,可以对血清9型提供100%的保护,但仍不能完全抵抗肺部病变及细菌在体内的定居。

3 研究展望

Apx毒素作为App最主要的毒力因子,同时也是最重要的保护性抗原,能诱导机体产生最大的保护力,且无须荚膜抗原的参与,对于不同血清型之间的交叉保护也起着重要的作用,是高效疫苗不可或缺的成分。在细菌灭活菌苗中加入细菌产生的Apx后,疫苗的保护力大为提高,主要成分为毒素的亚单位疫苗对动物的保护力优于缺少 Apx毒素的商业灭活苗。由于提取天然Apx的方法成本较高,产量低,不易实现大规模的生产,因而利用基因工程的方法,将毒素基因在廉价的原核表达系统大肠杆菌内高效表达,易于大规模培养,并降低了生产成本,且免疫原性和天然毒素没有差异。在研制疫苗时,对亲本株的选择上,要么是分离本地具强毒力的优势血清型,因其可以提供菌体以及毒素抗原,产生最大限度的保护;要么使疫苗含有多种血清型,能够尽可能地包括4种毒素,也就可以提供更全面的保护。

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