猕猴肝脏实验感染猪囊尾蚴的观察*

陈峥宏,刘 峰,包怀恩,吴晓娟,杨婷秀

2.贵州省人民医院,贵阳 550004

猪囊虫病是由于家猪食入链状带绦虫的虫卵,虫卵中幼虫在消化液作用下逸出,移行并在皮下、肌肉和脑组织等组织器官内发育为囊尾蚴而引起,人也可因食入虫卵而发生囊虫病。囊虫病呈世界性分布,我国的流行和分布也相当广泛,遍及全国。虽然猪囊尾蚴可寄生在中间宿主的肌肉、皮下、脑、眼等组织和器官,也包括肝脏[1-2],但往往只有临床表现明显的脑型、眼型和严重的皮肌型囊尾蚴病由于癫痫发作、视力障碍或皮下可见明显结节或包块才会引起人们的重视,肝囊虫病由于缺乏特异的临床表现使猪囊尾蚴在人肝脏的寄生和对健康的危害尚未引起人们的关注。本文以链状带绦虫虫卵感染猕猴,观察猕猴肝功能、肝脏声像图特征及病理变化特征,并对猕猴进行血清猪囊尾蚴抗体检查,为人肝囊尾蚴病的危害评估和临床诊断提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 链状带绦虫采自云南省大理白族自治州凤仪镇的近期有排绦虫节片史病人,以槟榔-南瓜子法驱虫,虫体用自来水、0.85%生理盐水漂洗后保存于灭菌的25%甘油水溶液运送至实验室,经形态学观察和分子鉴别鉴定为链状带绦虫。

1.2 实验动物 普通级医学实验用猕猴,雌性,体重为5.9 kg,重庆硕斯灵长类动物研究有限公司提供,合格证号：SCXR(渝)2008-0001。

1.3 主要试剂 肝功能检测试剂均为澳斯邦原装试剂;透明质酸放射免疫分析药盒,购自北京北方生物技术研究所;考马斯亮蓝蛋白质定量试剂盒,购自南京建成生物工程研究所;辣根过氧化物酶标记兔抗猴IgG,TMB显色试剂盒,购自北京博奥森生物科技公司;安定,贵州光定制药,批号 090817;氯胺酮,江苏恒瑞制药,批号071005。

1.4 猕猴的感染和B超检查 猕猴感染前抽取早晨空腹静脉血分离血清冻存于-20℃备用,经肌肉注射安定(0.2～0.3mg/kg)镇静和盐酸氯胺酮麻醉后(5mg/kg)以PHILIPS IU22型彩色超声仪,探头频率2.5～10.0 MHz,进行肝脏彩超检查。分别将5×105个链状带绦虫的虫卵加入饲料内喂食猕猴,专用饲料饲养,并每日喂食适量新鲜水果。感染第84 d,抽取空腹静脉血分离血清备用,麻醉后以同一台超声仪和同样的探头频率进行肝脏B超检查,记录病灶数目、大小、形态、内部及后方回声特征,将病变区图像局部放大,彩色多普勒血流速度量程调至低速血流状态(3～6cm/s),观察局部血流,并根据声像图特征提示超声诊断。

1.5 猕猴感染前后部分肝功能指标的检查 将感染前后的猕猴血清以拜耳1650全自动生化分析仪采用澳斯邦原装试剂进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、胆碱酯酶(CHE)和总胆汁酸盐(TBA)的检测;透明质酸(HA)检测采用固相放射免疫法按药盒操作说明进行。

1.6 猕猴的剖检、囊尾蚴的分布及肝病变组织的病原核酸检测和病理学检查 于感染第90d以肌肉注射安定(1 mg/kg)和氯胺酮(20mg/kg)麻醉猕猴致死,测量体重,剖检全身各组织器官,采集囊尾蚴,并立即置于0.5%(mL/mL)胆汁盐水中,于室温下孵育至头节翻出,将翻出头节的囊尾蚴放置于一滴生理盐水中,于载玻片上直接用光学显微镜观察后加覆盖玻片制片镜检。仔细检查猕猴肝组织,取病变组织经10%甲醛固定后进行常规石蜡切片、HE染色镜检。

1.7 猕猴血清中猪囊尾蚴抗体的检查

1.7.1 猪囊尾蚴抗原的制备 将猪带绦虫虫卵实验感染的家猪肌肉内检获的囊尾蚴经PBS洗涤后用玻璃匀浆器匀浆,并用超声波粉碎仪破碎,经台式离心机12 000r/min离心15min,取上清滤过除菌后以考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒定量,于-20℃保存备用。

1.7.2 血清中猪囊尾蚴抗体的ELISA法检测 以4.9μ g/mL的猪囊尾蚴抗原包被酶标板孔,每孔100μ L,置4℃包被过夜,洗涤液洗涤各孔,加1/10、1/100、1/200、1/400 的感染前、后猕猴血清各100μ l,每份稀释血清重复3孔,同时设置 3孔 PBS对照。经37℃孵育1h,洗涤后加1/1 000的辣根过氧化物酶标记兔抗猴IgG各100μ L,37℃孵育1h,以TMB显色试剂盒按说明书操作显色和终止后于450nm测量各孔吸光度值。

2 结 果

2.1 猕猴肝脏B超检查 感染前猕猴肝脏B超检查未见异常,感染后猕猴肝脏见11个大小较为均一的结节,形态多为类圆形、椭圆形或梭形,边界一般较清楚,均未见包膜,内部呈不均匀的低回声或混合性回声,多数结节壁上有强回声光斑且后方伴声影(图1)。CDFI显示病灶内均无血流信号,周围可见正常的动脉、肝静脉及门静脉样血流信号走行。超声诊断提示：肝脏多发实性结节伴钙化斑。

图1 感染链状带绦虫囊尾蚴84 d的猕猴肝脏超声图Fig.1 Liver ultrasonography of the macaque infected by T.solium larva(arrows showing nodules)

2.2 部分肝功能指标检测 感染前和感染第84d的猕猴空腹静脉血中部分酶及透明质酸的检查结果见表1。

表1 感染前后猕猴的部分肝功能指标Table 1 Indicators of liver function of the monkey before and after infection

2.3 囊尾蚴的分布及肝组织病变的病原检查和病理学检查 感染链状带绦虫囊尾蚴90天的猕猴体重为3.5kg,在猕猴肌肉内检获11个囊尾蚴(图2),心包膜下检获2个囊尾蚴,肝实质内见11个结节,大小为(1.0×1.5)～(1.5×3)mm,其余组织器官未见囊尾蚴和病变。病变组织的石蜡切片HE染色镜检显示,病灶内可见坏死的虫体,周围有纤维结缔组织包裹伴炎症细胞浸润,以嗜酸性粒细胞为主,部分可见淋巴细胞浸润及肉芽肿,肉芽肿周围纤维结缔组织增生(图3),可见肝细胞脂肪变性(图4)和坏死。

图2 猕猴肌肉内的囊尾蚴Fig.2 Cysticerci from the monkey's muscle

2.4 血清囊尾蚴抗体的ELISA检测 感染前、后各稀释血清ELISA检测的OD450见表2。与PBS对照相比,以大于PBS对照孔OD值2.1倍,即大于0.202为显色阳性,则感染后血清经400倍稀释,囊尾蚴抗体仍为阳性,而感染前各稀释血清囊尾蚴抗体均为阴性。

3 讨 论

表2 猕猴感染前、后血清抗体ELISA检测的OD450(3次实验结果均值)Table 2 OD450of the ELISAtest on the serum antibody of the monkey before and after infection(mean value of three tests)

肝寄生虫病在我国许多地区均有流行,多为血吸虫、肺吸虫、包虫及蛔虫引起肝脏占位性病变的报道。虽然已有研究表明,除了皮肤、肌肉、眼和脑组织,家猪肝脏也是猪带绦虫囊尾蚴的重要寄生部位[1-2],但肝囊虫病对人的危害尚未引起关注。本文以猪带绦虫虫卵感染猕猴的实验结果表明,猪囊尾蚴也可寄生于猕猴的肝脏。部分肝功能相关血清酶的检测表明,感染前后猕猴血清ALT、AST数值有所差异,但均在猕猴血清ALT、AST正常值范围之内[3]。人的肝血清酶学指标中,ALT、AST等仅在急性或重型肝炎患者与健康正常人群表现出显著的差异性,在慢性肝炎和酒精性肝炎则缺乏诊断价值[4]。TBA则是肝损伤的敏感指标[5-6],它是胆固醇在肝脏中分解的代谢产物,其生成和代谢与肝脏密切相关。在各种肝脏疾病时,肝脏对胆汁酸的重吸收减少,从而导致血清中 TBA的含量增加。因此测定血清中TBA可以直接反映肝脏的摄取、合成及排泄功能。在肝细胞有较轻微损伤时,TBA的升高比其它常规肝功能指标更敏感[5-6]。胆碱酯酶是肝细胞合成的水解酶,随着肝脏纤维化程度的加重,CHE合成逐渐减少[6]。透明质酸是一种广泛存在于细胞外基质中的高分子多糖,主要由肝内皮细胞进行降解,慢性肝损伤时,肝间质细胞增殖,HA的合成增加;肝窦内皮细胞受损,摄取分解HA功能降低;并且肝组织纤维化时肝内有不同程度的血流紊乱,门静脉分流增加,也减少了窦内皮细胞对HA的摄取分解,导致血清HA升高,是反映肝纤维化的重要指标[7]。在健康人群中,TBA值上下波动在均值的54%以内,ChE上下波动在均值的17%以内[5],HA上下波动在均值的46%以内[7]。本实验中猕猴感染后与感染前相比,TBA增高3.4倍,ChE降低25%,HA增高88%。由于缺乏猕猴血清TBA、ChE和HA正常值的资料,难以根据这三项指标来判断该猕猴肝脏代偿功能是否异常,然而这三项指标的变化提示肝脏ChE合成、对胆汁酸重吸收的减少和对HA摄取分解能力的降低,猪囊尾蚴在猕猴肝脏的寄生已导致肝脏的损伤。

超声检查显示猕猴肝脏病灶多为不均匀低回声,其壁上有强回声伴后方声影,考虑为感染后组织自身修复过程中纤维组织增生,致声阻抗差增大,从而使回声增强,并伴后方声衰减。病灶内CDFI检查无血流信号,提示肝囊虫病病变多为少供血的病变。本文的结果表明,超声显像有很高的软组织分辨力,能灵敏地显示出肝脏占位病变。但是,寄生虫感染性病灶的声像图特征缺乏特异性,需要进行超声引导下穿刺活检方能鉴别良恶性病变和肝寄生虫感染性病变[8],若要确诊为何种寄生虫感染,尚需结合临床和流行病学资料以及进行相关的病原学、免疫学或分子生物学检查。本实验中受染猕猴肝脏的结节周围可见嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润,可初步诊断为寄生虫感染。免疫学诊断,即血清囊尾蚴IgG的ELISA检测亦提示猪囊尾蚴的感染。

尽管肝脏具有较强的代偿功能,但囊尾蚴的寄生和引起的炎症反应已经导致了本实验中猕猴肝脏的局灶性损伤,并对肝功能造成一定的影响,其危害应引起关注,特别是在猪带绦虫和囊虫病流行区,许多误食猪带绦虫虫卵或感染猪带绦虫成虫的人由于未出现明显的神经系统症状或皮下未见结节而忽视了感染的存在,农村医疗条件的限制使已经感染了猪囊尾蚴,肝脏已出现病变的患者未能得到及时诊断和治疗。本文实验结果表明,在猪囊虫病和猪带绦虫病流行区,血清猪囊尾蚴抗体检测结合肝脏B超检查,有助于发现肝囊虫病患者。

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