溶剂法纯化还原型谷胱甘肽工艺的研究

徐丽萍，王 鑫，邢 超

(哈尔滨商业大学食品工程学院，省高校食品科学与工程重点实验，黑龙江省哈尔滨150076)

溶剂法纯化还原型谷胱甘肽工艺的研究

徐丽萍，王 鑫，邢 超

(哈尔滨商业大学食品工程学院，省高校食品科学与工程重点实验，黑龙江省哈尔滨150076)

玉米胚中提取的还原型谷胱甘肽，除含有肽类物质外，还含有糖类、色素类、蛋白质类等水溶性物质，由于这些物质的存在，将使还原型谷胱甘肽的含量降低，并使其生理活性减弱，因此，为提高还原型谷胱甘肽化合物的纯度，通过溶剂法对玉米胚中还原型谷胱甘肽粗提物进行纯化工艺研究。选择乙醇为溶剂沉淀法纯化还原型谷胱甘肽最佳溶剂，通过单因素及正交实验确定最佳工艺条件为:还原型谷胱甘肽粗提液与乙醇体积比为1∶1;乙醇浓度为100%;搅拌时间为15min。采用双光束紫外分光光度法测定有机溶剂法纯化玉米胚还原型谷胱甘肽的的得率为24.41%。通过红外光谱测定纯化后物质为还原型谷胱甘肽。

还原型谷胱甘肽，纯化，乙醇

谷胱甘肽(Glutathione)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，化学名称为N－(N－L－γ－谷氨酰－L－半胱氨酰)甘氨酸，其分子式为 C10H17O6SN3，属于含有疏基的小分子活性肽［1］。谷胱甘肽广泛分布于动物、植物、谷物和油料种子中，还原型谷光甘肽(GSH)广泛存在于自然界、动物肝脏、酵母和植物胚芽中，其中玉米胚中GSH的含量约为112～126mg/100g［2］。人和动物的血液中也含有较多的GSH［3－4］，细胞中GSH的含量约为0.5～10mmol/L［5］，植物组织中GSH含量则较低。国内目前在GSH方面的研究处于起步阶段，对纯化的研究甚少，目前分离提纯GSH的方法，见诸文献报道的主要有:铜盐法、双水相法、树脂法和有机溶剂法［6］。虽然利用以上几种方法来生产GSH在实验室均具有可行性，但是它们在工业化生产过程中却还存在着许多问题，有些甚至无法实现工业化。目前，国际上日本等国家已经开始采用离子交换树脂进行一些研究，并取得了很好的效果，国内关于离子交换树脂分离GSH的研究已经逐步展开，但是不够深入，故一直未能实现工业化。本文就进一步探讨GSH的分离进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

还原型谷胱甘肽粗提物 实验室自制;标准还原型谷胱甘肽 美国sigma公司;乙醇 天津市天新精细化工开发中心。

高速离心机TG16型 长沙英泰仪器有限责任公司;旋转蒸发仪R－205型 上海申胜生物技术有限公司;真空干燥箱ZDF－6090型 上海恒一科学仪器有限公司;紫外可见分光光度计TU－1900型 北京普析通用仪器有限责任公司;红外光谱仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶剂的选择 根据GSH难溶于醇、丙酮等溶剂这一性质，采用溶剂沉淀法将GSH沉淀析出。分别采用乙醇、乙醚和丙酮对GSH进行纯化，比较三种溶剂对GSH得率的影响，选择最佳溶剂［7］。

1.2.2 溶剂沉淀法纯化还原型谷胱甘肽的单因素选择

1.2.2.1 GSH提取液与乙醇体积比的选择 准确吸取GSH提取液10mL，分别按GSH提取液与乙醇体积比2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5取90%乙醇5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL搅拌20min，离心后将沉淀物冷冻干燥，测定GSH得率。确定最佳体积比。

1.2.2.2 乙醇浓度的选择 准确吸取GSH提取液10mL，加入10.0mL乙醇，分别采用乙醇浓度为60%、70%、80%、90%、100%搅拌20min，离心后将沉淀物冷冻干燥，测定GSH得率。确定最佳乙醇浓度。

1.2.2.3 搅拌时间的选择 准确吸取 GSH提取液10mL，加入10.0mL乙醇，分别采用浓度为90%的乙醇搅拌5、10、15、20、25min，离心后将沉淀物冷冻干燥，测定GSH得率，确定最佳搅拌时间。

1.2.3 溶剂沉淀法纯化还原型谷胱甘肽最佳工艺条件的确定 根据单因素实验的结果，选择影响纯化效果的三个主要因素:GSH提取液与乙醇体积比(A)、乙醇浓度(B)、搅拌时间(C)，采用正交设计表L9(34)安排实验。因素水平表见表1。

表1 因素与水平表

1.2.4 溶剂沉淀法制备还原型谷胱甘肽纯化物 取10mL GSH提取液，加入10mL 90%乙醇，搅拌时间为20min。将沉淀冷冻干燥即得GSH纯化物，并按下式计算产品得率:

式中:W－GSH得率(%);m－GSH纯化物质量(g);M－GSH粗提物质量(g)。

1.2.5 还原型谷胱甘肽红外光谱分析 分别将经干燥的 GSH1mg左右，与经干燥的 KBr粉末100～200mg在玛瑙研钵中研细后压片，在4000～400cm－1范围内进行红外光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择结果

选择乙醇、乙醚、丙酮在最优条件下进行溶剂沉淀法纯化玉米胚中还原型谷胱甘肽，结果见表2。由表2可知，乙醇纯化谷胱甘肽的得率较高。乙醚中含有微量水、乙醇和其他杂质，而丙酮常含有少量的水及甲醇、乙醛等还原性杂质，纯化效果均没有乙醇的好。并且乙醚和丙酮都是易挥发有毒有机溶剂，而乙醇作为一种常见有机溶剂，易挥发，对环境污染及危害小，是单一使用效果最好的有机溶剂，所以选择乙醇做沉淀法溶剂。

表2 溶剂选择结果

2.2 GSH提取液与乙醇体积比对纯化的影响

GSH提取液与乙醇体积比为可变因素，其它两个因素固定不变，即乙醇浓度为90%，搅拌时间为20min，考察GSH粗提液与乙醇体积比对纯化效果的影响，其结果见图1。

图1 GSH提取液与乙醇体积比的选择

从图1中可知，当GSH提取液与乙醇体积比从2∶1至1∶1时，GSH得率有所增加;当二者比例小于1∶1后，GSH得率呈下降趋势。由于体积比升高导致GSH浓度逐渐降低，可能是由于GSH在溶液中易氧化，使最终GSH得率较少。因此选择体积比的最佳比例为1∶1。

2.3 乙醇浓度对纯化的影响

乙醇浓度为可变因素，其它三个因素固定不变，即GSH提取液与乙醇体积比为1∶1，搅拌时间为20min，考察乙醇浓度对纯化效果的影响，其结果如图2所示。

图2 乙醇浓度的选择

从图2中可知，乙醇浓度在60%～80%期间，GSH的得率上升明显，乙醇浓度在80%～100%时的GSH得率趋于平稳，在90%时GSH得率取得最大值。由于GSH不溶于醇类物质，低浓度乙醇会溶解少量的GSH，纯化不完全。因此选择乙醇最佳浓度为90%。

2.4 搅拌时间对纯化的影响

搅拌时间为可变因素，其它三个因素固定不变，即乙醇浓度为90%，GSH粗提液与乙醇体积比为1∶1，考察搅拌时间对纯化效果的影响，其结果见图3。

从图3中可知，搅拌时间在5～15min时，GSH得率随时间的延长而增大，超过15min后，曲线呈下降趋势，下降缓慢。所以选择最佳搅拌时间为15min。

2.5 溶剂沉淀法纯化还原型谷胱甘肽最佳工艺条件的确定

通过正交实验确定最佳的纯化工艺，为了使实验数据更加准确，每组实验均做三次平行实验，考察指标为GSH得率，其实验结果见表3。

图3 搅拌时间的选择

表3 溶剂沉淀法纯化GSH正交实验结果

2.5.1 方差分析 由表4的极差分析可知，各因素对GSH提取率影响的大小顺序为A＞C＞B，即GSH提取液与乙醇体积比＞搅拌时间＞乙醇浓度。最佳的因素水平组合为A2B3C1。即体积比1∶1、乙醇浓度100%、搅拌时间15min，GSH得率为24.41%。

表4 正交实验方差分析表

2.6 红外光谱检测结果分析

图4 标准GSH红外扫描图谱

由图4～图5和表5红外光谱数据可以看出，纯化后的物质显示了特有的巯基、羧基、氨基、酮基等特征频率，并且纯化后的物质和标准品出峰位置均在振动频率范围内。GSH的特征基团为巯基，特征峰在2600～2500cm－1范围内，标准GSH振动频率位于2527.25cm－1，纯化后物质移至2524.36cm－1，证明纯化后的物质为GSH［8－10］。

图5 纯化样品红外扫描图谱

表5 红外光谱分析

3 结论

本研究选用三种有机溶剂进行纯化实验，结果表明乙醇纯化效果最好。乙醇沉淀法纯化GSH的最佳工艺条件为:GSH粗提液与乙醇体积比为1∶1，乙醇浓度为100%，搅拌时间为15min。纯化后可将还原型谷胱甘肽的含量提高到24.41%。采用红外光谱检测，证明纯化后物质和标准品还原型谷胱甘肽结构一致。确定纯化后物质为还原型谷胱甘肽。

［1］沈亚领，李爽，迟莉丽.谷胱甘肽的应用与生产［J］.工业微生物，2000，30(2):41－45.

［2］宋增廷，姜宁，张爱忠，等.谷胱甘肽生物学功能的研究进展［J］.饲料研究，2008(9):25－27.

［3］Jones D P.Intracellular catalase function:Analysis of the catalytic activity by product formation in isolated liver cells［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics，1982，214:806－814.

［4］刘振玉.谷胱甘肽的研究与应用［J］.生命的化学，1995，15 (1):19－20.

［5］刘晓颖，丁毅.猪血谷胱甘肽的提取与纯化［J］.中国生化药物杂志，1999，20(5):246－247.

［6］王淼，范崇东，苏晓晋.阳离子交换法分离纯化酵母细胞提取液中的谷胱甘肽［J］.食品科学，2007，28(4):211－217.

［7］许铁成，王家骐，朱立江，等.有机溶剂纯化谷胱甘肽方法初探［J］.发酵科技通讯，2008，37(3):13－15.

［8］陈俭梅，周林.几种谷胱甘肽的检测方法［J］.山东食品发酵，2007(3):26－29.

［9］Douglas C.实验设计与分析［M］.北京:中国统计出版社，1998:589－592.

［10］袁志发，周静芋.实验设计与分析［M］.北京:高等教育出版社，2000:381.

Study on the purification process of reduced glutathione with the method of solvent

XU Li－ping，WANG Xin，XING Chao
(Key Laboratory of Food Science and Engineering，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

The reduced glutathione contains carbohydrates，pigments，proteins and other water－soluble substances except peptides which was extracted from corn germ，the content of reduced glutathione will be reduced and the physical activity will be less because the presence of these substances，the extract of reduced glutathione was purified with the method of solvent from corn germ for improving the purity of glutathione compounds.Selecting ethanol as the best solvent of precipitation method，the optimum conditions of solvent precipitation method purified GSH by single factors and orthogonal experiments were determined as follows:GSH extract and ethanol of 1∶1 volume ratio，the ethanol concentration was 100%，stirring time was 15min.The content of reduced glutathione in corn germ was purified with the methods of solvent precipitation by dual－beam UV spectrophotometer，which was 24.41%.The material of extraction from the corn germ was reduced glutathione by IR.

GSH;purification;ethanol

TS201.1

B

1002－0306(2011)12－0348－03

2011－08－16

徐丽萍(1963－)，女，硕士，教授，研究方向:农产品加工与贮藏工程。

黑龙江省自然科学基金(C200813)。