酶解罗非鱼鱼骨粉制备可溶性钙的工艺研究

杨贤庆，杨 燕，2，马海霞，李来好，郝淑贤，魏 涯

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，广东广州510300; 2.上海海洋大学食品学院，上海201300)

酶解罗非鱼鱼骨粉制备可溶性钙的工艺研究

杨贤庆1，杨 燕1，2，马海霞1，李来好1，郝淑贤1，魏 涯1

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，广东广州510300; 2.上海海洋大学食品学院，上海201300)

采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶酶解罗非鱼鱼骨粉，以酶解液中可溶性钙含量、水解度和氮收率为特征性指标，利用L16(54)正交实验设计优化水解鱼骨粉的工艺条件。结果表明:采用胃蛋白酶水解鱼骨粉，效果优于其它三种酶;胃蛋白酶水解鱼骨粉的最佳条件是:pH2.0、料液比1∶3、酶用量0.3%、时间5h、温度37℃;所得酶解液中钙含量为23.68g/L，水解度和氮收率分别达14.07%和56.35%，可溶性氮含量达97.43%，Fe、Zn、Mg、P的含量分别为0.36、3.84、716.67mg/L和10.89g/L。

罗非鱼鱼骨粉，可溶性钙，胃蛋白酶，水解度

钙是人体的必需元素，它不仅是构成骨骼组织的重要物质，而且在机体各种生理和生物化学过程中起着重要作用［1］。钙离子是凝血因子，参与凝血过程;能直接与肌钙蛋白结合引起肌肉收缩;参与激素的合成和分泌、神经递质的合成与释放;对维持细胞的生存和功能起着重要作用［2］。充足的钙的摄入可以减少患慢性病的风险，如骨质疏松症、高血压和肠癌以及大量的其他身体机能的失调［3］。补钙不仅要保证一定钙含量的摄入，还要保证钙的有效利用［4］。动物骨经适当处理后可溶性钙含量增大，有利于肠对钙的吸收，能大大提高钙的生物利用率［5－6］。罗非鱼是我国淡水重要养殖对象之一，也是我国具有竞争力的优势出口水产品之一。近年来我国罗非鱼产量及加工出口量呈逐年上升之势。目前，我国罗非鱼的加工产品主要是冻罗非鱼片、面包罗非鱼和冻全鱼，罗非鱼在加工过程中会产生大量的鱼头、鱼排等加工下脚料，以往这些下脚料多作为饲料原料廉价处理或者被扔掉，附加值很低，而且污染环境［7－8］。鱼骨中除含有蛋白质、脂肪等营养元素以外，还含有大量的Ca、Fe、Zn、Mg、P及胶原成分［9］。经过酶解的鱼骨含有丰富的水溶性营养物质如多肽、氨基酸等还有大量的可溶性钙，可以被人体直接吸收，是开发骨源补钙产品的良好资源［10］。本实验以罗非鱼加工下脚料鱼排为原料制备鱼骨粉，对罗非鱼骨粉进行酶解，以酶解液中可溶性钙含量、水解度和氮收率为实验指标，选出适宜的蛋白酶和最佳的酶解工艺条件，以充分提高罗非鱼骨蛋白及骨钙的利用率，为今后进一步加强罗非鱼下脚料的综合开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻罗非鱼鱼骨 广州市恒发水产有限公司提供;胰蛋白酶 25万U/g，AMRESCO;胃蛋白酶 50万U/g，sigma;木瓜蛋白酶 100万U/g，MERCK;中性蛋白酶 8万U/g，北京奥博星生物科技有限公司;钙标准溶液 1000μg/mL，Merck;氧化镧 天津市福晨化学试剂厂;盐酸、氢氧化钠、硝酸、甲醛等均为分析纯;实验所用水 均为去离子水。

DKN612C恒温干燥箱 上海进申工贸有限公司;FW100高速万能粉碎机 东莞市塘厦兴万电子厂;PB－10酸度计 sartorius仪器有限公司;MARS微波消解仪 美国CEM公司;AA240FS原子吸收光谱仪 美国Varian公司;DK－S24电热恒温水浴锅上海华岩仪器设备有限公司;TDZ25－WS多管架自动平衡离心机 湖南沪康离心机有限公司;HG63卤素水分测定仪 瑞士Mettler Toledo公司;2050脂肪自动分析仪(索氏抽提系统)、2300全自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司;VULCAN 3－550马弗炉 美国Neytech公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 新鲜鱼排→清洗→蒸煮→清洗→干燥→粉碎过筛→鱼骨粉→加酶水解→灭酶→离心→上清液→可溶性钙液

1.2.2 鱼骨粉的制备 用清水将鱼排表面污物洗净，常压蒸煮2h后，洗去附着的鱼肉及去油。105℃烘4h，然后将干燥后的鱼骨粉碎成颗粒过筛(孔径0.15mm)，制得所需的鱼骨粉。

1.2.3 蛋白酶的筛选 实验中分别采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶对骨粉进行水解。将骨粉与水以1∶4(m/m)比例混合，以酶用量2000U/g蛋白质分别加入四种蛋白酶，混匀后分别在各自理论最适宜的温度和pH(各酶的最适温度和pH见表1)条件下水解5h后，90℃灭酶10min，然后经4000r/min离心10min，得到酶解上清液。取上清液测定鱼骨粉蛋白质的水解度、氮收率和可溶性钙含量。

表1 4种酶的理论最适酶解条件

1.2.4 pH对水解效果及钙含量的影响 将骨粉与水以1∶4(m/m)比例混合，在不同pH下分别进行酸水解和酶水解，考察在pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0时，胃蛋白酶对水解液中可溶性钙含量、总氮和水解度的影响。每组实验做3个重复。

1.2.5 胃蛋白酶水解工艺条件的优化 在上述实验的基础上，选择胃蛋白酶水解鱼骨粉，选择料液比、酶用量、时间和温度四因素，以钙含量、水解度和氮收率为评定指标，采用L16(54)正交实验对胃蛋白酶水解工艺条件进行优化，其因素水平如表2所示。

表2 正交实验因素与水平表

1.2.6 测定指标 水分测定:直接干燥法，参照GB/T 5009.3－2003《食品中水分的测定》执行;灰分测定:灼烧称重法，参照GB/T 5009.4－2003《食品中灰分的测定》执行;脂肪测定:索氏抽提法，参照GB/T 5009.6－2003《食品中脂肪的测定》执行;蛋白质、总氮量测定:微量凯氏定氮法，参照GB/T 5009.5－2010《食品中蛋白质的测定》执行;钙、铁、锌、镁含量的测定:原子吸收法，参照GB 5413.21－2010《婴幼儿食品和乳品中钙、铁、锌、钠、钾、镁、铜和锰的测定》执行;磷的测定:参照GB/T5009.87－2003《食品中磷的测定》执行。上清液中氨基态氮测定:甲醛电位滴定法［11］。酶解液中可溶性氮含量的测定［12］:将10mL 20%三氯乙酸溶液加到10mL酶解液中，混合振荡，静置60min后于4000r/min离心20min，取上清液测定总氮量。

可溶性氮(%)=三氯乙酸上清液中总氮含量/酶解液中总氮含量×100%

水解度DH(%)=(上清液中氨基酸态氮含量×上清液体积)/(原料氮含量×原料质量)×100%

氮收率(%)=(上清液中氮含量×上清液体积)/(原料氮含量×原料质量)×100%

2 结果与分析

2.1 罗非鱼骨粉的基本成分

罗非鱼骨粉的基本成分见表3。

表3 罗非鱼鱼骨粉的基本成分

2.2 最佳水解酶种类的确定

由表4可知，在酶用量相同的情况下，四种酶酶解与空白对照相比均差异极显著(P＜0.01)，其中胃蛋白酶酶解液中的钙含量、水解度和氮收率均显著高于其它三种酶(P＜0.01)，分别是14.45g/L，9.89%和41.04%。四种酶的酶解液中钙含量大小顺序依次为:胃蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶，水解度和氮收率大小顺序依次均为胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。四种酶的水解度和氮收率呈正相关，而水解度和氮收率高，钙含量不一定相应地增高。胃蛋白酶是一种酸性蛋白酶，能分解蛋白质中芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所组成的肽键，而胰蛋白酶只断裂精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键，Ca2+、Mg2+等金属离子可降低其活性，木瓜蛋白酶有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质，中性蛋白酶能断裂蛋白质中亮氨酸和苯丙氨酸的肽键［13］。采用胃蛋白酶水解鱼骨粉，钙含量、水解度和氮收率较高，可能与骨粉液的pH有关，胃蛋白酶酶解时需将pH调至2.0左右，酸对蛋白水解亦有影响。根据实验结果选择胃蛋白酶，且进一步考察pH对水解效果的影响。

表5 pH和胃蛋白酶的水解效果对照

表4 四种酶水解鱼骨粉结果比较

2.3 pH对水解效果及钙含量的影响

固定料液比为1∶4(m/m)，水解温度37℃，水解时间5h，加酶量为 2000U/g蛋白质，水解效果见表5。

由表5可知，两种水解方式都能达到一定的水解效果且有利于钙的溶出，pH接近中性时酸水解和酶水解效果很低，在pH2.0左右时水解效果都明显提高。由于酸水解过程中随着水解液中pH的下降，H+增多，骨蛋白展开程度增大，肽键断裂，分子内部的疏水基团暴露在分子表面，羟磷灰石毫无保护的裸露出来，在H+作用下，水解度增大，可溶性钙含量逐渐增多［10］。从结果可知，低pH有利于钙的溶出，pH1.0时可溶性钙含量最高，但水解度和氮收率低于添加胃蛋白酶水解组。这是由于酸和胃蛋白酶协同作用的结果，在酸性条件下，骨蛋白有一定程度的水解，同时肽键的暴露，容易受到蛋白酶的攻击，增加其对酶的敏感性。胃蛋白酶水解在pH2.0时水解度和氮收率最高，pH1.0时胃蛋白酶活性被抑制，水解效果较低。综合考虑上清液中的钙含量和水解效果，过低的pH易对氨基酸等营养物质造成破坏［14］，故选用胃蛋白酶在pH2.0条件下水解罗非鱼鱼骨粉。

2.4 正交实验优化胃蛋白酶水解工艺条件

根据因素水平表进行正交实验，测定酶解液的钙含量、水解度和氮收率，正交实验结果如表6所示。

表6 正交实验结果

2.4.1 极差分析与讨论 由表7极差分析可知，A、B、C、D对钙含量、氮收率的影响大小均是:A＞D＞C＞B，最优组合分别为A2B2C3D2、A2B3C3D2;对水解度的影响为:A＞D＞B＞C，最优组合为A2B3C4D2。从影响钙含量、水解度和氮收率的各因素水平均值可以看出，料液比为1∶3时酶解液的钙含量、水解度和氮收率都为最高。料液比过高或过低都不利于钙的溶出，同时也不利于蛋白质的水解，这是因为鱼骨中的钙大多是以羟磷灰石结晶形式存在的，羟磷灰石中磷酸钙和氢氧化钙是钙离子在鱼骨中的主要存在形式［15］。同时由于鱼骨中存在大量的蛋白质，骨中的羟磷灰石与胶原纤维有机结合，在外部还有水合壳的保护［16－17］。因此，鱼骨中钙含量虽然丰富，但游离钙含量很少。只有去除外围的胶原纤维，酸碱才能作用于羟磷灰石上，使骨钙转换为游离钙。当底物浓度较高时，水解液的粘度增大，影响胃蛋白酶的扩散，不利于酶与底物充分接触，而当料液比大于1∶3时，底物浓度较小，酶未与骨粉充分接触，不利于水解。在37℃时钙含量、水解度和氮收率都最高，这是由于温度影响蛋白酶的活性，温度过低会抑制酶活，温度过高则会加速胃蛋白酶的失活，不利于包围在鱼骨外面的胶原纤维的解开，骨钙未能充分裸露出来，从而影响钙的溶出。在钙含量考察指标中酶用量为0.3%时可溶性钙含量最高，而水解度和氮收率均在酶用量为0.4%时最高。酶解液中钙含量和氮收率在酶解5h效果最好，水解度在酶解时间为6h时最高，因为随着酶解时间的增加，水解效果逐渐增强，超过一定酶解时间，酶活力下降不利于水解。

表7 极差分析表

表8 方差分析表

表9 水解产物成分分析

2.4.2 方差分析与讨论 在方差分析的基础上，计算各因素对考察指标变异的贡献率(因素平方和与总平方和之比)见表8。贡献率的大小可对因素的重要程度进行量化，某一因素的平方和对总平方和的贡献率越大，则表示该项因素对该评价指标的影响能力越强［18］。

由表8可知，A、D对钙含量均可视为重要影响因素，其中A达到极显著水平、贡献率达70.2%，D达到显著水平、贡献率为16.0%;A、B、D可视为水解度的重要影响因素，其中A达到显著水平，贡献率分别为48.5%、19.9%、18.8%;A对氮收率的影响达到显著水平，贡献率为54.3%，D的贡献率也达到24.0%，但没达到显著水平。

2.4.3 最优水平组合的确定 由直观分析表可知，不同评价指标下各因素的最优水平存在一定的差异，但表8中的方差分析和因素贡献率表明在确定最优水平时应优先考虑酶解液中的钙含量，然后考虑水解度和氮收率。同时根据显著性分析，可以确定料液比为1∶3，温度为37℃最佳。酶用量和时间均为不显著因素，从经济成本考虑，选择酶用量为0.3%，酶解时间 5h。据此最优水平组合应为A2B2C3D2，即料液比1∶3，酶用量0.3%，时间5h，温度37℃。在所得酶解液中钙含量为23.68g/L，水解度14.07%，氮收率56.35%。

2.5 水解产物成分分析

鱼骨中不仅含有丰富的蛋白质，还含有大量的Ca、Fe、Zn、Mg、P及胶原成分。三氯乙酸中可溶性氮含量是评价水解产物中小分子肽类的重要指标［19］。可溶性氮含量越高，表明产物中小分子肽类越多。根据胃蛋白酶最佳水解条件进行水解，测得三氯乙酸中可溶性氮含量为97.43%，结果表明，胃蛋白酶水解产物中绝大部分为小分子肽类，可溶性较高。水解产物主要成分分析见表9。

3 结论

3.1 实验用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶四种酶酶解罗非鱼骨粉，结果表明，胃蛋白酶酶解效果优于其它三种酶(P＜0.01)，得到的酶解液钙含量、水解度和氮收率最高。

3.2 在低pH条件下，添加胃蛋白酶能显著提高罗非鱼骨粉水解液中的钙含量、水解度和氮收率，当pH为2时，胃蛋白酶酶解罗非鱼骨粉效果最好，钙含量、水解度和氮收率达到最大值。

3.3 胃蛋白酶酶解鱼骨粉的最佳条件:pH2.0、料液比1∶3、酶用量 0.3%、时间 5h、温度 37℃，钙含量为23.68g/L，水解度和氮收率分别达到14.07%和56.35%。

3.4 胃蛋白酶水解产物中可溶性氮达到97.43%，表明水解产物多为低分子肽类，可溶性高。水解液中Fe、Zn、Mg和P的含量分别为0.36、3.84、716.67mg/L和10.89g/L。

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Enzymatic hydrolysis of tilapia bone for preparing the soluble calcium

YANG Xian－qing1，YANG Yan1，2，MA Hai－xia1，LI Lai－hao1，HAO Shu－xian1，WEI Ya1
(1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，National Research and Development Center for Aquatic Product Processing，Guangzhou 510300，China; 2.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201300，China)

Trypsinase，papain，neutral protease and pepsin were added to hydrolyze bone powder of tilapia and compare the effect.The optimal hydrolysis conditions of bone powder were obtained by analyzing the soluble calcium content，degree of hydrolysis and recycle rate of nitrogen by L16(54)orthogonal array design.The results showed that pepsin hydrolysate showed the strongest effect，which optimal hydrolysis conditions were:pH2.0，solid－liquid ratio 1∶3，enzyme concentration(E/S)0.3%，time 5h and temperature 37℃.With the optimal conditions，the degree of hydrolysis and recycle rate of nitrogen reached 14.07%and 56.35%，respectively.The soluble calcium content was 23.68g/L.Trichloroacetic acid soluble nitrogen content reached 97.43%.The contents of Fe，Zn，Mg，P were 0.36，3.84，716.67mg/L，10.89g/L，respectively.

bone powder of tilapia;soluble calcium;pepsin;degree of hydrolysis

TS254.9

B

1002－0306(2011)12－0221－05

2011－08－24

杨贤庆(1963－)，男，研究员，研究方向:水产品加工与质量安全。

国家现代农业产业技术体系(CARS－49);国家农业科技成果转化资金项目(2010GB2E000335);广东省科技计划项目(2009A020700004)。