雪卡毒素人工抗原合成及鉴定

张彩霞，闫鸿鹏，赵肃清，张 焜，周丽华

(广东工业大学轻工化工学院，广东广州510006)

雪卡毒素人工抗原合成及鉴定

张彩霞，闫鸿鹏，赵肃清*，张 焜，周丽华

(广东工业大学轻工化工学院，广东广州510006)

雪卡毒素是一种存在于珊瑚鱼中的海洋毒素，极低剂量就会引起中毒。为了建立雪卡毒素的免疫分析方法，必须合成其人工抗原才能制备抗体。以雪卡毒素的结构类似物莫能菌素为半抗原，采用琥珀酸酐法将其改造成莫能菌素－琥珀酰半酯(MON－HS)，再用混合酸酐法将其与大分子载体牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联，成功制备出了雪卡毒素人工抗原MON－HS－BSA和MON－HS－OVA。以MON－HS－BSA为免疫抗原免疫Balb/c小鼠，以MON－HS－OVA为包被抗原，用间接竞争酶联免疫吸附法(Ci－ELISA)检测到小鼠血清中产生了雪卡毒素的抗体，说明已成功合成雪卡毒素人工抗原，该抗原可用于制备雪卡毒素单克隆抗体。

雪卡毒素，莫能菌素，人工抗原，Ci－ELISA

图1 雪卡毒素结构式

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莫能菌素钠盐 广州国奥生物;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂 Sigma公司;HRP标记的羊抗小鼠IgG、TMB武汉博士德公司;30%双氧水、无水乙醇 天津百世;雪卡毒素 本实验室提取纯化，另文发表;BalB/c小鼠 6～8周龄，体重18～22g，雌性，购于广东省医学实验动物中心。

RT－2100C型酶标仪 Rayto;KDC－40型低速离心机 科大创新中佳分公司;恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;LGJ－12型冷冻干燥机 北京松源华兴科技公司;1mL、200μL、10μL移液枪 BioPette; pH计 上海雷磁仪器厂;DYY－6C型电泳仪 北京六一仪器厂;TU－190 紫外－可见分光光度计 北京普析通用公司。

图2 莫能菌素结构式

1.2 实验方法

1.2.1 雪卡毒素人工抗原合成

1.2.1.1 半抗原改造及纯化 参考文献［11－12］方法，将莫能菌素钠盐500mg溶于5mL无水吡啶中，60℃搅拌加热，缓慢滴加721.5mg琥珀酸酐吡啶溶液，持续加热搅拌反应2d，TLC监测反应。待反应完毕后滴加几滴水终止反应。反应液真空干燥除去吡啶后溶于10mL二氯甲烷，用0.02mol/L HCl洗涤4次，然后用双蒸水洗涤2次(2mL/次)，Na2SO4除去水分，过滤后真空干燥。产物溶于3mL二氯甲烷，过硅胶柱进一步分离纯化(二氯甲烷∶甲醇=9∶1梯度洗脱)，TLC监测(展开剂为二氯甲烷∶甲醇=9∶1)，莫能菌素Rf=0.54，莫能菌素－琥珀酰半酯Rf=0.41，收集Rf=0.41的点合并，真空干燥箱干燥即得半抗原改造产物。

1.2.1.2 雪卡毒素人工抗原合成及鉴定 混合液A:莫能菌素－琥珀酸酐(192.95mg，0.25mol)溶于2.5mL二氧六环中，冷却到10℃，边搅拌边逐滴加入三丁胺60μL，氯甲酸异丁酯33μL，混合液于10℃持续搅拌30min。混合液B:BSA(340mg)或OVA(225mg)分别溶于22mL，0.1mol/L，pH9.5的碳酸盐缓冲溶液中，然后缓慢加入22mL二氧六环，置于4℃。将A液逐滴加入到B液中，持续搅拌，反应5h，混合物4℃透析，1～2d透析液为:0.02mol/L碳酸盐缓冲溶液∶二氧六环=1∶1; 3～4d透析液:蒸馏水;透析后冻干，4℃保存。

1.2.1.3 SDS－PAGE鉴定偶联结果 15%分离胶，5%浓缩胶，检测人工免疫抗原与BSA，包被抗原与OVA在电泳图中的位置差别，从而鉴定偶联是否成功。

1.2.1.4 考马斯亮蓝法和香草醛法鉴定结合比 参考文献方法［12－13］，分别以BSA和OVA为标准蛋白，绘制蛋白含量标准曲线。以莫能菌素为标准药物，绘制莫能菌素含量标准曲线。根据标准曲线计算出人工合成抗原的偶联比。

1.2.2 多抗制备 6～8周龄，体重18～22g，雌性BalB/c小鼠4只，分别皮下及足垫注射100μg抗原与等体积弗氏完全佐剂的乳化物，2周后第二次腹腔及足垫注射100μg抗原与等体积弗氏不完全佐剂的乳化物，如此交替重复免疫，于第4次免疫10d后尾部采血，4℃静置过夜，分离血清。

1.2.3 间接竞争ELISA法建立 用棋盘滴定法确定血清抗体最佳包被抗原浓度，最佳一抗，二抗浓度。雪卡毒素溶于甲醇，用30%甲醇溶液［14］稀释到系列浓度1×103、1×102、1×101、1×100、1×10－1、1× 10－2、1×10－3、1×10－4ng/mL，用间接竞争ELISA法测出不同浓度药物对血清抗体的抑制作用，绘制竞争抑制曲线。抑制率(%)=(B－B0)/(BN－B0)× 100%，其中，B为检测孔OD值，BN为阴性孔OD值，B0为空白孔OD值。

2 结果与讨论

2.1 半抗原改造

用琥珀酸酐法将莫能菌素末端羟基与琥珀酸酐偶联，从而在莫能菌素中引入羧基作为与蛋白偶联的活性位点，合成莫能菌素－琥珀酰半酯(MONHS)。通过硅胶柱层析作进一步的纯化处理将产物中的吡啶和剩余的琥珀酸酐除去得到较纯的MONHS。用TLC监测，如图3所示，为纯化后得到较纯的半抗原改造产物。

图3 莫能素－琥珀酰半酯纯化前后薄层层析图

2.2 SDS－PAGE鉴定偶联是否成功

用SDS－PAGE得到BSA，BSA－MON，OVA，OVA－MON的电泳图，从图4中比较可以看出，第1泳道OVA的分子量小于第二泳道OVA－MON的分子量;第三泳道BSA的分子量小于第四泳道BSA－MON的分子量。由此推测，半抗原与OVA和BSA偶联成功，并可根据分子量大小计算出偶联率。

图4 包被抗原和免疫抗原SDS－PAGE电泳图

2.3 偶联比的测定

由考马斯亮蓝法和香草醛法测定免疫原中蛋白质和莫能菌素的含量，对照标准曲线求出MON－BSA中BSA浓度为2.766mg/mL，相当于4.12×10－5mmol/mL;莫能菌素浓度为0.534mg/mL，相当于7.62×10－4mmol/mL; MON－OVA中OVA浓度为2.925mg/mL，相当于6.50 ×10－5mmol/mL;莫能菌素浓度为0.38mg/mL，相当于5.42×10－4mmol/mL，因此求出MON－BSA中BSA与MON的偶联比约为1∶18.5。同理求得MON－OVA中，OVA与MON的偶联比为1∶7。

2.4 间接竞争ELISA法建立

通过棋盘滴定，确定最佳包被抗原浓度为5μg/mL，一抗最佳工作浓度为1∶16000，二抗最佳浓度为1∶10000(如图5所示)。根据间接竞争ELISA实验结果，以雪卡毒素浓度的对数lgC为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制出竞争抑制曲线(见图6)。从图6中可以看出，在包被抗原浓度不变的情况下，随着雪卡毒素浓度的增大，雪卡毒素与包被抗原竞争结合抗体的能力增大，抑制率增强，可以证明免疫小鼠血清中含有抗雪卡毒素抗体。

图5 血清抗体棋盘滴定

图6 雪卡毒素竞争抑制标准工作曲线

3 结论

对雪卡毒素结构类似物莫能菌素进行修饰，用混合酸酐法与BSA偶联纯化后得到雪卡毒素人工抗原，经SDS－PAGE法，免疫分析方法综合鉴定，表明雪卡毒素人工抗原合成成功，可以用于制备雪卡毒素单克隆抗体。

［1］赵肃清，张焜，方岩雄，等.雪卡毒素中毒的现状及监测分析概况［J］.南方水产，2006，2(2):68－70.

［2］袁建辉，王秀，赵肃清，等.雪卡毒素中毒的诊断与检测［J］.岭南急诊医学杂志，2007，12(2):119－120.

［3］骆和东，林建，冷建荣.小鼠生物检测法测定热带性珊瑚礁鱼毒性的研究［J］.中国卫生检验杂志，2007，17(12):2182－2184.

［4］Ron L Manger，Linda S Leja，Sue Y Lee，et al.Tetrazolium－Based Cell Bioassay for Neurotoxins Active on Voltage－Sensitive Sodium Channels:Semiautomated Assay for Saxitoxins，Brevetoxins，and Ciguatoxins［J］.Analytical Biochemistry，1993，214:190－194.

［5］Richard J Lewis，Aijun Yang，Alun Jones.Rapid extraction combined with LC－tandem mass spectrometry(CREM－LC/MS/ MS)for the determination of ciguatoxins in ciguateric fish flesh［J］.Toxicon，2009，54:62－66.

［6］刘红河，刘桂华，杨俊，等.高效液相色谱－电喷雾串联质谱法测定鱼体中雪卡毒素［J］.分析化学，2009，37(11):1675－1678.

［7］Brett Hamilton，Mira Hurbungs，Jean－Paul Vernoux，et al. Isolation and characterization of Indian Ocean ciguatoxin［J］. Toxicon，2002，40:685－693.

［8］Lewis，RJ，Sellin，et al.Purification and characterization of ciguatoxins from moray eel［J］.Toxicon，1991，29:1115－1127.

［9］Takeshi Tsumuraya，Ikuo Fujii，Masayuki Inoue，et al. Production of monoclonal antibodies for sandwich immunoassay detection of ciguatoxin 51－hydroxyCTX3C［J］.Toxicon，2006，48:287－294.

［10］Serge Pauillac，Therese Halmos，Hubert Labrousse，et al. Production of highly specific monoclonal antibodies to monensin and development of a microELISA to detect this antibiotic［J］. Journal of Immunological Methods，1993，164:165－173.

［11］魏瑞成.莫能菌素多克隆抗体制备及应用［D］.南京农业大学，2006:24－29.

［12］王廷华，李官成，Xin－Fu Zhou.抗体理论与技术［M］.北京:科学出版社，2005:92－108.

［13］冯仁青，郭振泉，宓捷波.现代抗体技术及其应用［M］.北京:北京大学出版社，2006:108－109.

［14］江湖.黄曲霉毒素B1间接竞争ELISA检测方法的建立与单克隆抗体免疫亲和柱的初步研制［D］.南昌大学，2005: 29－46.

Synthesis and identification of artificial antigen of ciguatoxin

ZHANG Cai－xia，YAN Hong－peng，ZHAO Su－qing*，ZHANG Kun，ZHOU Li－hua
(Department of Pharmacy Engineering，Faculty of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，China)

Ciguatoxin was a kind of marine toxin exists in coral fish.A trace residual might lead to ciguatera poisoning.In order to build an immunochromatography assay method，it was necessary to synthesize artificial antigen of ciguatoxin firstly.Monensin，an analogue of ciguatoxin，was reconstructed to succinyl monensin through the reaction between succinic anhydride and monensin，and then coupled to bovine serum albumin(BSA)and ovalbumin(OVA)by mixed acid anhydride method to synthesize the artificial antigen MON－HS－BSA and MONHS－OVA.The antibodies against ciguatoxin were raised in serum of MON－HS－BSA immunized BalB/c mice by indirect competitive ELISA.The above results showed that the artificial antigen of ciguatoxin was synthesized successfully and it could be used to develop monoclonal antibodies against ciguatoxin in the future.

ciguatoxin;monensin;artificial antigen;indirect competitive ELISA

Q939.91

A

1002－0306(2011)12－0203－03

雪卡毒素是最主要的一种引起人类中毒的珊瑚鱼毒素，由小鱼吃海藻，大鱼吃小鱼而富集。它是世界范围内最普遍的海洋毒素，约0.1ppb～100pg/mL的雪卡毒素便会引起中毒，全世界每年至少有50000人遭受雪卡毒素伤害［1－2］。国内外学者对雪卡毒素的检测方法进行了大量研究，建立了小鼠生物法［3］、细胞毒性实验法［4］、高效液相色谱串联质谱［5－6］等。但是这些方法样品前处理复杂，繁琐费时，所需仪器设备昂贵，不能现场操作。因此，建立一种简便易行的雪卡毒素的检测方法具有重要意义。ELISA法具有灵敏快速，特异性强，操作简便等优点，近年来备受关注。雪卡毒素(结构式如图1所示)由13个醚环构成，合成完整的雪卡毒素分子几乎不可能，而提取纯化产率非常低［7－8］。由于雪卡毒素纯品的价格相当昂贵，为1美元/ng，因此，国外报道了合成雪卡毒素的3～5个醚环用于雪卡毒素半抗原制备人工抗原和抗体［9］，而我们在研究中发现莫能菌素(结构式见图2)具有与雪卡毒素相似的醚环结构，对其改构后作为半抗原合成雪卡毒素人工抗原应当为一种合理有效的方法，为此我们开展这方面的研究探索。

2010－11－15 *通讯联系人

张彩霞(1988－)，女，硕士研究生，研究方向:免疫化学。

国家自然科学基金(20872020，20672023);广东省自然科学基金(8251009001000005)。