多西他赛脂质体制备工艺研究

2011-11-01池王胄

中国医药指南 2011年23期

关键词：冻干药量脂质体

池王胄

（上海新先锋药业有限公司，上海 201203）

多西他赛脂质体制备工艺研究

池王胄

（上海新先锋药业有限公司，上海 201203）

现阶段，研究抗肿瘤药物脂质体制剂项目是国内外新型给药系统的一大热点，本文研究一种具备较好稳定性的多西他赛脂质体的制备方法，并考察其理化性质及体外释放特性。

多西他赛；脂质体；制备工艺

1 材料与仪器

1.1 药品试剂

试验用药品及试剂包括：含量为99.48%的多西他赛；PC含量为97.5%z的注射用蛋黄卵磷脂；德国LipoidGmbH公司生产的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG 2000；规格为20mg/0.5mL的多西他赛注射液；美国天地公司生产的乙腈；美国Gibco公司所生产的RPMI1640；小牛血清；美国Sigma公司生产的噻唑蓝；其余试剂为市场销售分析纯。

1.2 仪器

试验用仪器包括：美国沃特斯公司所生产的沃特斯高效液相色谱仪；英国马尔文仪器有限分司所产的Nano ZS 90纳米激光粒度电位测定仪；瑞士布琦公司所产的旋转蒸发仪；意大利GEA Niro Soavi公司所生产的高压均质机；上海东富龙所产的Lyo0.4真空冷冻干燥机；上海和杰科技公司所产的Biomax-10超滤膜Millipore超滤管；上海绿鸟科技公司所产的透析袋，截留相对分子质量为14 000；以及JEM-1010透射电子显微镜和ZRS-8G智能溶出仪。

2 试验方法

2.1 建立多西他赛含量的测定方法

本文利用HPLC法测量多西他赛和脂质体中多西他赛的含量，脂质体冻干粉针再添加蒸馏水进行重建为脂质体胶体溶液，再将其精密移取适量，用甲醇破乳、定容。色谱的条件为：色谱柱250mm×4.6mm，5μm，为LichrospherC18；流动相为60∶40的乙腈-水，流速1mL/min；柱温30℃；进样量20μL；检测波长229nm。经方法学考察证明：处于本色谱条件下，多西他赛的测定不会受到辅料的干扰；多西他赛峰面积和药物质量浓度的回归方程如下所示：

式中：A：多西他赛峰面积；c：药物质量浓度

线性范围：0.025～5μg/mL

2.2 制备注射用西他赛脂质体

先把2g多西他赛和30g注射用蛋黄卵磷脂，还有2.4g DSPE-PEG 2000共同放入茄形瓶，然后将乙醇添加进去充分溶解脂质。接着将茄形瓶放在旋转蒸发仪上，温度调至40℃，使溶剂减压蒸发，从而类脂溶液就结成一层非常均匀的薄膜状。把茄形瓶由蒸发仪中取下后置于干燥箱中，干燥箱为真空，过夜除尽溶剂。再取用pH值为5.5、10mmol/L的磷酸盐缓冲液（该缓冲液中溶有9%的蔗糖）以及直径3mm左右的玻璃珠适量，在氮气的保护作用下旋转洗膜，水化液转至高压均质机中，以100MPa压力进行5次均质，获取半透明的脂质体胶体深液，过滤膜后将滤液分装于西林瓶。然后进行冻干，冻干条件如下：-45℃的预冻温度，再进行4h保温；第1次干燥温度为-30℃，进行30h的保温；第二次的干燥温度为25℃，再进行10h保温，即可获取注射用多西他赛脂质体，置于4℃环境保存以备后用。

2.3 外观性状

注射用多西他赛脂质体外观为白色完整块状，色泽均一且外形饱满。取用一瓶多西他赛冻干脂质体，加入5mL水后室温环境摇匀，即可获得半透明的蓝色乳光状胶体。

2.4 测定多西他赛脂质体的载药量及包封率

因为多西他赛的溶水性较差，因此将其进行水合重建时，在未经包封的情况下，多西他赛呈药物晶体的形式析出，将物晶体进行过滤去除，水中所残留的即为包裹多西他赛脂质体及未少量未包裹的游离药物。取用一瓶冻干脂质体，将5mL水加入其中进行水合重建，再用5%的葡萄糖进行稀释，直至浓度为0.5mg/mL，即临床给药浓度，过滤后取用续滤液4mL，放入超滤管后进行超滤处理，设定转速3000r/min，离心转20min，将下清液收集起来直接HPLC进样。同时要取利用过滤膜过滤前的脂体混悬液2mL以及滤液2mL，将二者分别放在规格为10mL的量瓶中，利用甲醇定容，通过超声促使其完全挥发，再分取20μL进样，其浓度计算方法为将所得峰面积代入标准曲线，则包封率可表达为下式：

式中：A：过滤膜前脂体混悬液；B：滤液；C：下清液

2.5 体外释放度对释放行为的影响

透析袋经过预处理后，置于释放介质中过夜浸泡。将冻干脂质体蒸馏水复溶后，采用5%的葡萄糖稀释，直至DTX质量浓度达0.5mg/mL。将1mL置于透析袋中，扎紧两端，后绑在溶出仪小浆上，置于小杯，该小杯内盛放100mL的1mol/L水杨酸钠-pH 7.4 PBS，然后做体外释放实验，实验介质温度为（37±0.5）℃，转速100r/min。根据设定好的时间间隔取5mL释放介质进行浓度的测定，并补充释放介质5mL，HPLC测定DTX在释放介质中的深度，并算出药物累积释放百分比。

3 试验结果[1-4]

3.1 测定多西他赛脂质体包封率和载药量

经测定，多西他赛冻干脂质体重建后其包封率为99.89%，误差为±0.06；总脂质按照投药量来计算，其载药量为5.7%，误差为±0.01。

3.2 考察脂质体形态

通过透射电镜对重建后的脂质体进行观察，观察结果显示其大小与粒径测定仪的检测结果接近，并且多数粒子圆整结构为球形、近球性，并且可以看到非常清晰的、类似指纹环状的螺旋结构。

3.3 多西他赛脂质体体外释放度

在未加入血浆时，注射液与脂质体的体外释放行为相接近，在8h以内，释放时间越长释放量会随之增加，拟合释放度数据，与Higuchi方程相符，释放方程为别表达如下，其中脂质体释放方程式为：

注射液释放方程式为：

而在8h以后，无论是脂质体还是注射液，释放均达到一定的平台期，时间变化对释放量的影响不再明显。脂质体与注射液在加入血浆后，其释放量均有明显降低，在8h以内二者的释放行为差异显著，脂质体1h内的释放为0，而注射液在0.5h内释放为0。拟合释放数据，与Higuchi方程相符，其方程表达式分别如下，其中脂质体：