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高糖环境下HGF对肾小球系膜细胞增殖及TGF-β1 的影响

2011-11-01王保忠

中国现代药物应用 2011年17期
关键词:分泌量系膜甘露醇

王保忠

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症之一,肾小球系膜细胞(MsC)功能的研究对阐明DN发病机制具有重要意义。近年研究表明转化生长因子(TGF-β1)在DN发病机制中起重要作用。肝细胞生长因子(HGF)能有效抑制与慢性肾脏疾病及慢性肾功能衰竭密切相关的肾间质纤维化的进展过程。本研究以大鼠肾小球系膜细胞(RMC)为靶细胞,用高糖诱导造成体外培养的RMC功能紊乱,观察RMC的增殖情况、TGF-β1的分泌变化以及 HGF干预作用,以阐明HGF对糖尿患者肾脏可能具有的保护作用,为DN的防治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 大鼠肾小球系膜细胞(RMC)的培养与处理 RMC常规复苏后移入细胞培养瓶中静置培养。培养2~3 d,用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞传代。RMC由中国医学科学院基础医学研究所提供。

1.2 MTT法测细胞增殖 将RMC接种于96孔板,按以下分组给药:①正常对照组(用DMEM培养液培养细胞,葡萄糖终浓度5.5 mmol/L),②高糖组(DMEM培养液中加入D-葡萄糖,葡萄糖终浓度25.0 mmol/L),③高糖+HGF组(25.0 mmol/L葡萄糖,50 ng/ml HGF),加入相应培养液培养不同时间(12,24,48,96 h),每组设6个复孔。反应结束后每孔加入25 μlMTT(5 mg/ml)溶液,继续孵育4 h,弃上清,每孔加入100 μl二甲基亚枫(DMSO),振荡30 min后于酶标仪490 nm处测光吸收(OD)值。OD值越大,表明细胞增殖越旺盛。

1.3 酶联免疫吸附技术测细胞上清液中TGF-β1水平 (1)TGF-β1分泌检测分组:将RMC接种于96孔培养板中,分为3组:①正常对照组(葡萄糖浓度5.5mmol/L);②高糖组(葡萄糖浓度25.0mmol/L),甘露醇对照组 (20.0mmol/L甘露醇,使其渗透压与高糖组相同)。分别于培养的12、24、48、96 h收集细胞,用双抗体夹心法(ABC-ELISA)检测TGF-β1分泌量。每组均设6个复孔。另外将RMC分为:①正常对照组(葡萄糖浓度5.5mmol/L),②高糖组(葡萄糖浓度25.0mmol/L)③高糖+HGF组(葡萄糖浓度25.0mmol/L,HGF浓度分别为25、50、100、200ng/ml)。分别培养48 h后,用双抗体夹心法(ABC-ELISA)测定此时TGF-β1分泌情况。每组实验设6个复孔。(2)按照TGF-β1/ELISA试剂盒(由上海生物工程公司提供)说明书进行操作,最终于酶标仪450nm处测(OD)值。大鼠TGF-β1的浓度与OD值成正比。根据TGF-β1标准品A值曲线y=ymax×x^n/(k^n+x^n),换算所测上清液中TGF-β1的含量。

2 结果

2.1 高糖和HGF对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响 12 h时间点各组间细胞增殖均无显著性差异。24 h时间点,高糖组较正常对照组相比促进细胞增殖(P<0.05),高糖+HGF组较高糖组相比,可以抑制细胞增殖(P<0.05)。48,72和96 h时间点,高糖组较正常对照组相比细胞增殖受抑(P<0.05)。高糖+HGF组较高糖组相比促进细胞增殖(P<0.05)。而且呈时间依赖性,(见表1)。

2.2 高糖对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1分泌的结果 高糖组TGF-β1分泌量从24 h开始升高,持续至96 h达到高峰。甘露醇组同样出现TGF-β1分泌,作用24 h后同对照组相比存在差异(P<0.05)。但同高糖组相比,甘露醇组的表达量又远远低于高糖组(P<0.05)。在96 h,甘露醇组与对照组相比没有差异(P>0.05)。说明甘露醇组并没有促进TGF-β1分泌,(见表2)。

2.3 高糖和HGF对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1分泌的结果 高糖组中TGF-β1分泌量较高,HGF组与高糖组相比,TGF-β1分泌量明显下降,有统计学差异(P<0.05),且呈剂量依赖性,(见表3)。

表1 高糖与HGF作用下肾小球系膜细胞的增殖(OD值)(n=6)

表2 高糖作用下肾小球系膜细胞TGF-β1的分泌量(n=6 ng/ml)

表3 高糖TG与F-βHGF作用下肾小球系膜细胞1的分泌量(n=6)

3 讨论

DN是糖尿病患者常见的微血管并发症之一,其主要的病理变化为肾小球肥大,ECM产生增多。MsC是肾小球内产生ECM的主要固有细胞,在DN发病过程中不仅是被动受害者,而且也是直接参与者,通过其自身代谢和功能改变直接影响DN进程。细胞因子在DN的发病中起着重要的作用。TGF-β1是唯一对ECM形成具有广泛调节作用的细胞因子。HGF主要由间质细胞产生。肾脏是HGF表达最高的脏器。HGF能够调节细胞的多种功能如细胞的生存,增殖,迁移以及分化。

有研究证实,采用抗TGF-β1抗体抑制TGF-β1的合成可以缓解肾脏纤维化的程度[1]。进一步说明TGF-β1在肾脏纤维化中的重要性。本实验也同样证实,高糖诱导肾小球系膜细胞分泌TGF-β1,于高糖作24 h开始合成增加,并且随着高糖持续作用,TGF-β1呈现持续性高表达。同时我们对渗透压因素进行测定,结果证实,高糖诱导细胞的改变可能部分是由于渗透压因素所致,然而高糖诱导细胞表达TGF-β1,并不完全依赖渗透压介导。说明高糖本身就可以诱导细胞发生损伤。因此,本研究在体外培养肾小球系膜细胞,将高糖作为一个重要因素进行诱导刺激,部分模拟了体内糖尿病环境。

近年来研究表明,减少ECM的积聚,拮抗细胞因子的不良作用,抑制MsC的增殖活化已成为防治肾小球硬化、延缓肾小球疾病进展中的重要环节[2]。在正常组织中,TGF-β1和HGF处于一种互逆平衡状态。在病理状态下,若HGF占优势则利于损伤修复;若TGF-β1占优势则组织出现纤维化改变[3]。Cruzado等[4]发现HGF基因治疗降低了进展期 DN的蛋白尿,缓解了系膜增多和肾小球硬化。与其能遏止系膜区 TGF-β1和结缔组织因(connective tissue growth factor,CTGF)的表达上调有关。我们研究发现,高糖诱导早期,细胞并没有发生TGF-β1高表达。高糖作用晚期,TGF-β1表达开始增加。加入HGF可以降低TGF-β1的分泌。局部HGF水平降低以及TGF-β1表达升高,可能共同参与了肾脏纤维化过程[5,6]。本研究证实 HGF可以直接抑制 TGF-β1的分泌,并且存在剂量依赖性抑制作用,随着HGF剂量的增加,其抑制TGF-β1表达的作用也更显著。另外,有其他相关研究证实,HGF还可以通过抑制纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)表达[7]使ECM合成减少,来预防ECM沉积。从上述结果可以看出HGF和TGF-β1生物活性是相反的。

综上所述,高糖刺激肾小球系膜细胞TGF-β1出现稳定高表达,而给予外源性的HGF后,系膜细胞TGF-β1的分泌减少,而且呈时间依赖性。我们将在以后的研究中进一步阐明HGF在介导DN发病中的具体机制,为DN防治提供新途径。

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