橡实淀粉生物乙醇化橡实品种和菌种的筛选

田玉峰，李安平*，谢碧霞，丁彦鹏，崔富贵

(中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

橡实淀粉生物乙醇化橡实品种和菌种的筛选

田玉峰，李安平*，谢碧霞，丁彦鹏，崔富贵

(中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

对湖南南岳采集的几种橡实品种的营养成分和发酵性能，以及4种酵母菌对茅栗淀粉发酵的适应性能进行比较。结果表明：12种橡实品种中以茅栗、栓皮栎、多脉青冈和锥栗等4个品种的淀粉含量及单株产量均较高，而单宁含量较低；锥栗和茅栗发酵后的醪液酒精体积分数和淀粉利用率显著高于栓皮栎和多脉青冈(P＜0.05)，而还原糖含量却相反(P＞0.05)；安琪耐高温高活性干酵母和南阳混合酵母(1308)与丹宝利高活性干酵母、K字酵母和南阳五号酵母(1300)相比，发酵后茅栗醪液酒精体积分数和醪液残还原糖含量方面具有显著优势(P＜0.05)，是橡实淀粉生物乙醇化的最优菌种。

生物乙醇化；橡实品种；菌种；筛选

燃料乙醇的推广将消耗大量淀粉原料，而目前燃料乙醇的生产主要是以玉米和陈化粮等粮食为原料，结果是出现与民争粮的问题，而且这种用粮食生产燃料乙醇的方式与国家粮食战略安全是相矛盾的。因此，寻求廉价易得的生物质原料成为国内外研究的热点。

我国橡实资源相当丰富，年产橡实估计在6×106～7×106t，但其利用率非常低。橡实淀粉含量很高，一般达到50%～70%，是很好的淀粉质原料[1]。如果用橡实淀粉发酵生产燃料乙醇，不但可以节约大量的粮食，而且对开发野生植物橡实资源，发展林业经济具有重要的意义。筛选出性能优异的酒精酵母菌株是提高淀粉出酒率和降低原料消耗及生产成本的关键。本实验以从湖南南岳采集的12种橡实品种为原料，根据橡实产量、淀粉含量、淀粉酒精转化率等指标筛选出最适合燃料乙醇生产的橡实品种和酵母菌株，以期为规模化生产燃料乙醇提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

锥栗(Castanea henryi)、茅栗(Castanea seguinii Dode)、小红栲(Castanopsis carlesii)、栓皮栎(Quercus variabilis Blume)、苦槠(Castanopsis sclerophylla)、硬斗石栎(Lithocarpus hancei)、东南石栎(Lithocarpus harlandii)、美叶石栎(Lithocarpus calophyllus)、长叶石栎(Lithocarpus harlandii)、多脉青冈(Cyclobalanopsis multinervis)、细叶青冈(Cyclobalanopsis myrsinaefolia)、大叶青冈(Quercus glauca Thunb)均采自湖南南岳衡山。

安琪耐高温高活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；丹宝利高活性干酵母 广东丹宝利酵母股份有限公司；K字酵母、南阳五号酵母(1300)、南阳混合酵母(1308) 湖南轻工业研究所。

1.2 方法

淀粉的测定[2]：按GB/T 5514—85《粮食、油料检验淀粉测定法》中的酸水解法测定；单宁的测定[3]：采用硫酸亚铁铵返滴重络酸钾法；粗纤维的测定[2]：按GB/T 5515—85《粮食、油料检验粗纤维素测定法》；总糖的测定[4]：先将总糖水解，然后用DNS法测定；蛋白质的测定[2]：按GB/T 5009.5—1985《食品中蛋白质的测定方法》中的凯氏定氮法测定；酒精度的测定[4]：取100mL成熟的发酵醪液到蒸馏烧瓶中，加100mL水，混匀后蒸馏。取馏出液100mL，用酒精比重计测定馏出液中的酒精体积分数；醪液还原糖的测定[4]：取5mL醪液过滤，将滤液稀释至100mL容量瓶，用DNS法测定。淀粉利用率的计算[2]：由于12种橡实品种的淀粉含量不一样，酒精体积分数与残还原糖含量不能直接反映淀粉的实际利用率。利用橡实淀粉含量(α)和酒精体积分数(φ)可计算出淀粉利用率(v)。

式中：v为淀粉利用率/%；m为橡实原料质量/g；φ为酒精体积分数/%；α为橡实淀粉含量/%；56.82%为纯淀粉的理论出酒率。

2 结果与分析

2.1 12种橡实营养化学成分含量

橡实种仁含有丰富的营养物质，特别是淀粉的含量很高，一般可达50%～70%左右。12个从湖南省南岳衡山采集的橡实品种的营养化学成分测定结果见表1，单株产量结果见图1。

图1 12种橡实单株产量Fig.1 Starch yields per plant of 12 varieties of acorn

由表1可知，12个橡实品种的淀粉含量均大于50%，但各品种之间含量有显著性差异(P＜0.05)，其中以茅栗、栓皮栎和多脉青冈最高，锥栗、硬斗石栎和美叶石栎次之，长叶石栎淀粉含量最低；12个橡实品种的单宁的含量有显著性差异，其中以栓皮栎最高，苦槠和大叶青冈次之，锥栗、硬斗石栎、东南石栎和长叶石栎最低；各品种间的粗纤维、总糖和粗纤维差别不显著(P＞0.05)。

淀粉含量越高，则橡实的生物乙醇化产量越高；单宁对酵母发酵具有一定的抑制作用，因此单宁含量越少越有助于提高乙醇产量[5]；此外，在选取适合乙醇产业化生产的橡实品种时，不仅要考虑淀粉含量和单宁含量，而且还需考虑橡实的单株产量以便产业化生产。根据林业调查，从8年生的12种橡实品种的单株产量图可以看出，栓皮栎产量最高，其次是茅栗、多脉青冈和锥栗。

表1 湖南省主要橡实种仁化学成分含量Table 1 Major chemical composition of acorn kernels from 12 varieties

因此，综合考虑各因素的影响，选取茅栗、栓皮栎、多脉青冈和锥栗等4个淀粉含量高、单宁含量低、产量高的品种做进一步淀粉的生物乙醇化转化研究。

2.2 4种橡实品种发酵情况的比较

安琪耐高温高活性干酵母是工业上比较成熟的生产工业酒精酵母，因此选取它对锥栗、茅栗、栓皮栎、多脉青冈等4种橡实做发酵实验，找出1～2种最适合生产酒精的橡实品种。

在同等条件下，分别称取4种过80目筛的橡实淀粉各50g，按料液比1:2.5(m/V)加水调浆，加入200U/g糖化酶，在250mL三角瓶中混合均匀，接入体积分数10%活化后的酵母菌株，在34℃条件下恒温发酵72h[6]。发酵结束后分别测定和计算各品种醪液酒精体积分数、残还原糖含量(g/150mL)和淀粉利用率[7]。

2.2.1 4种橡实发酵后醪液酒精体积分数的比较

图2 4种橡实发酵后醪液酒精体积分数的比较Fig.2 Comparison of alcohol contents among fermented mashes from 4 varieties of acorn starches

由图2可知，4种橡实发酵后醪液酒精体积分数由高到低依次为锥栗、茅栗、多脉青冈、栓皮栎。通过ANOVA检验差异达0.05显著水平分析可知，锥栗和茅栗发酵后的醪液酒精体积分数没有显著性差异(P＞0.05)，而与栓皮栎和多脉青冈发酵后的醪液酒精体积分数存在显著性差异(P＜0.05)。锥栗淀粉含量虽然低于其他3个品种，但发酵后醪液酒精度却显著高于栓皮栎与多脉青冈。锥栗的单宁含量远低于栓皮栎与多脉青冈，而单宁对酵母发酵有很大的影响，因而造成了锥栗发酵醪液酒精度高于其他两个品种[8]。

2.2.2 4种橡实发酵后醪液残还原糖含量的比较

残还原糖含量的高低除了与酵母利用糖的能力有关外，还与橡实本身的化学成分等有关，如单宁可能会抑制酵母活力，从而降低淀粉的利用率。残还原糖含量越低，表明该种橡实被酵母转化为生物乙醇越多，一些抑菌成分对淀粉糖化和酵母利用糖的影响越小。由图3可知，4种橡实发酵后醪液残还原糖含量有显著性差异(P＜0.05)，其中锥栗与茅栗的发酵醪液残还原糖含量没有显著性差异(P＞0.05)，但与栓皮栎与多脉青冈相比存在显著性差异(P＜0.05)，由低到高依次为：锥栗、茅栗＜多脉青冈＜栓皮栎。4种橡实发酵后醪液残还原糖含量大小顺序与它们的单宁含量具有一致性。

图3 4种橡实发酵后醪液残还原糖含量比较Fig.3 Comparison of reducing sugar contents among fermented mashes from 4 varieties of acorn starches

2.2.3 4种橡实发酵后淀粉利用率的比较

图4 4种橡实发酵后淀粉利用率的比较Fig.4 Comparison of starch utilization rates among fermented mashes from 4 varieties of acorn starches

由图4可知，发酵72h末，4种橡实品种的淀粉利用率不同，其中茅栗与锥栗在淀粉利用率方面无显著性差异(P＞0.05)，但显著高于栓皮栎和多脉青冈(P＜0.05)。栓皮栎和多脉青冈的淀粉利用率均非常低。栓皮栎和多脉青冈虽然淀粉含量较高，但淀粉利用率低，由此也可初步判断，锥栗和茅栗相对而言更适合生产生物乙醇[9]。

2.3 不同菌种对茅栗发酵性能的比较

以茅栗为淀粉原料，工业中常用的5种酵母(包括安琪耐高温高活性干酵母、丹宝利活性干酵母、K字酵母菌株、南阳五号酵母(1300)、南阳混合酵母(1308)等5种)为发酵菌株，比较它们的发酵性能，以便选出最适合橡实淀粉发酵的酵母菌种[10-12]。

称取5份过80目筛的茅栗淀粉50g，按料液比1:2.5加水调浆，加入200U/g的糖化酶，在250mL三角瓶中混合均匀，分别接入体积分数10%经过活化或扩大培养后的5种酵母菌株，在34℃条件下恒温发酵。发酵后期，每隔12h分别测定醪液的酒精体积分数、残还原糖含量[13]。

2.3.1 5种酒精酵母发酵后茅栗醪液酒精体积分数的比较

图5 5种酒精酵母发酵后的茅栗醪液酒精体积分数比较Fig.5 Comparison of alcohol contents of fermented Castanea seguinii Dode mashes by 5 species of yeast

在相同原料和相同的条件下发酵，茅栗发酵醪液的酒精体积分数能直接反映淀粉的利用率和菌株的产酒性能。从图5可看出，5种酒精酵母在发酵时间不超过36h时产酒速度没有显著性差异(P＞0.05)。当超过48h后，5种酵母发酵性能存在显著性差异(P＜0.05)，安琪耐高温高活性干酵母、丹宝利活性干酵母、南阳混合酵母(1308)的产酒性能具有明显优势，安琪耐高温高活性干酵母、丹宝利活性干酵母、南阳混合酵母(1308)在48h时即可达到南阳五号酵母(1300)在72h时的酒精体积分数，K字酵母产酒速度最慢。60h后，安琪耐高温高活性干酵母的酒精体积分数超过南阳混合酵母(1308)，72h时，安琪耐高温高活性干酵母、南阳混合酵母(1308)明显优于其他3种菌种。

2.3.2 5种酒精酵母发酵后醪液残还原糖含量的比较

图6 5种酒精酵母发酵后茅栗醪液残还原糖含量的比较Fig.6 Comparison of residual sugar contents of fermented Castanea seguinii Dode mashes by 5 species of yeast

残还原糖含量越低，表明原料利用越充分[14]。由图6可知，各菌种发酵72h后醪液残还原糖含量存在显著性差异(P＜0.05)，其中K字酵母和南阳五号酵母(1300)的发酵醪液残还原糖含量较低，而安琪耐高温高活性干酵母、丹宝利活性干酵母、南阳混合酵母(1308)的残还原糖含量较低。

3 结 论

研究结果表明，锥栗和茅栗相对而言更适合生产生物乙醇。茅栗和锥栗发酵后醪液酒精体积分数、醪液残还原糖含量和淀粉利用率方面均无显著性差异(P＞0.05)，且明显优于栓皮栎与多脉青冈(P＜0.05)。通过对安琪耐高温活性干酵母、丹宝利活性干酵母、K字酵母、南阳五号酵母(1300)、南阳混合酵母(1308)等5种酵母发酵性能的比较可知，安琪耐高温高活性干酵母和南阳混合酵母(1308)发酵后醪液酒精体积分数和醪液残还原糖含量方面相对于另外3种酒精酵母具有显著优势(P＜0.05)，安琪耐高温高活性干酵母和南阳混合酵母(1308)是橡实淀粉生物乙醇化的最优菌种。

随着世界化石能源的日益匮乏，开发绿色可持续利用的能源成为了紧迫任务。以橡实淀粉为原料生产燃料乙醇可作为我国能源供应多元化战略的有益补充[15]。因此，研究橡实淀粉生物乙醇化橡实品种和菌种的筛选具有一定的现实意义。

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Screening of Acorn Varieties and Yeast Strains for Bio-ethanol Production

TIAN Yu-feng，LI An-ping*，XIE Bi-xia，DING Yan-peng，CUI Fu-gui (College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

In the present study, comparative investigations on the nutritional composition and fermentability of acorn kernels from 12 varieties and the adaptability of 5 species of yeast towards the fermentation of Castanea seguinii Dode starch were carried out. The results showed that among 12 varieties of acorn, Castanea seguinii Dode, Quercus variabilis Blume, Cyclobalanopsis multinervis and Castanea henryi contained higher starch content and starch yield per plant but less tannin. Fermented mashes from Castanea henryi and Castanea seguinii Dode starches exhibited significantly (P ＜ 0.05) higher alcohol content and starch utilization rate but significantly (P ＞ 0.05) lower reducing sugar content when compared to fermented mashes from Quercus variabilis Blume and Cyclobalanopsis multinervis starches. Angel high tem,p,erature active dry yeast and Nanyang yeast 1308 had a significant (P ＜ 0.05) advantage over Danbaoli high active dry yeast,“K” yeast and Nanyang yeast 1300 in terms of alcohol content and residual sugar content in fermented mash, thereby proving perfect strains for bio-ethanol production from acorn.

bio-ethanol production；acorn varieties；strain；screening

TQ223.122

A

1002-6630(2011)07-0207-04

2010-07-27

林业公益性行业科研专项(200804033)；湖南省科技计划项目(2010NK3040)

田玉峰(1986—)，男，硕士研究生，主要从事林副产品深加工研究。E-mail：tyf2880211@163.com

*通信作者：李安平(1967—)，男，教授，博士，主要从事林副产品深加工研究。E-mail：lianpinglianping@yahoo.com.cn