条斑紫菜活性肽的抗氧化作用

姚兴存，蒋 卉，舒留泉，盘赛昆

(淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005)

条斑紫菜活性肽的抗氧化作用

姚兴存，蒋 卉，舒留泉，盘赛昆

(淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005)

以条斑紫菜为原料，使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解紫菜蛋白制备活性肽，采用还原能力、清除羟自由基和二苯代苦味酰基自由基作为抗氧化性评价指标，研究紫菜活性肽的体外抗氧化活性，并测定其分子质量分布。结果表明：3种蛋白酶对紫菜蛋白具有较好的酶解效果，酶解产物具有一定的还原能力；自由基清除率和底物浓度之间具有正相关关系，木瓜蛋白酶酶解活性肽清除羟自由基活性最强，半数清除率质量浓度为0.397mg/mL；胃蛋白酶酶解活性肽清除二苯代苦味酰基自由基活性最强，半数清除率质量浓度为0.261mg/mL；经测定，具有抗氧化活性的小分子肽分子质量分布在148～1963u之间。

条斑紫菜；水解；活性肽；抗氧化

生物活性肽是蛋白质水解产生的含有数个到数十个氨基酸的多肽类物质，不仅具有营养价值，而且在人体代谢吸收过程中参与机体免疫调节、降低血压、促进矿物质吸收，具有重要的生理功能。国内外学者对多种来源不同的活性肽进行了广泛的研究，证明其具有较强的清除自由基能力和明显的抗氧化活性，已经成为全球食品和营养学等相关研究领域的一个重要发展方向[1]。近年来，利用现代酶工程技术，通过选择适当的蛋白酶进行水解，可以制备各种各样具有显著抗氧化作用的生物活性肽[2-6]。

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)是海洋食用藻类，大量人工养殖于长江以北的江苏沿海。紫菜的主要成分有约50%的碳水化合物和30%的粗蛋白[7]，此外还含有丰富的维生素、矿物质及生物活性物质等。目前紫菜的主要利用途径是制成紫菜饼干品供直接食用，深加工产品较少。近年来，有学者制备了坛紫菜和条斑紫菜活性肽，分别研究了其降血压活性[8-9]，但未见其抗氧化活性的研究报道。本研究利用当地紫菜加工生产中产生的边角料或残次品为原料，提取其中蛋白质，选取作用环境分别为酸性的胃蛋白酶、中性的木瓜蛋白酶、碱性的胰蛋白酶为水解酶，在适宜条件下将紫菜蛋白质水解为生物活性肽，研究紫菜活性肽的抗氧化活性，为开发紫菜保健食品，提高天然紫菜的利用价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

条斑紫菜为2010年3月连云港西墅物产有限公司生产紫菜干品时的边角料，凯氏定氮法[10]测定其蛋白质含量为33%。实验室中将紫菜50℃烘干至质量恒定，粉碎机粉碎，100目过筛后超临界CO2流体萃取脱去脂肪，储于广口瓶中干燥保存。

二苯代苦味酰基(DPPH)、辅酶I(NAD)、杆菌肽锌(Bacitracin zinc)、蓝色葡聚糖2000(Dextran blue 2000) 美国Sigma公司；SephadexG-15 美国Pharmacia公司；木瓜蛋白酶(酶活力为3×104U/g)、胰蛋白酶(酶活力为2.5×105U/g)、胃蛋白酶(酶活力为3×105U/g)、D-脱氧核糖、硫酸亚铁、铁氰化钾、硫代巴比妥酸(TBA)、抗坏血酸 上海生工生物工程技术服务有限公司；二丁基羟基甲苯(BHT)为进口分装；其他试剂皆为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Duo Flow层析系统 美国Bio-Rad公司；Primo R多用途台式高速冷冻离心机 美国热电公司；PHS-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；FW-100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；KS-300超声波粉碎机 宁波科生仪器厂；RE-501旋转蒸发仪 南京金正科教仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫菜蛋白酶解液的制备

精确称取一定量紫菜干粉，加100mL水混合均匀，超声辅助提取15min，4000r/min离心10min，取上清液定容到100mL。将提取液调节pH值，加入蛋白酶，充分均匀后按表1的适宜条件分别进行酶解，每间隔20min振荡一次，酶解结束后，100℃灭酶10min，自然冷却后8000r/min离心15min，收集上清液冷藏备用。

表1 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的适宜水解条件Table 1 Optimum hydrolysis conditions of three kinds of enzymes

1.3.2 总还原能力测定

采用普鲁士蓝反应法测定紫菜蛋白酶解液的还原能力[11]。取不同质量浓度的酶解液稀释液(0.15、0.3、0.6、1.2、2.4mg/mL)1.0mL，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液1mL及质量浓度为1g/100mL铁氰化钾溶液1.0mL，于50℃水浴反应20min后急速冷却，再加入质量浓度为10g/100mL三氯乙酸溶液1.0mL，振荡均匀后，3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入蒸馏水2.0mL和质量浓度为0.1g/100mLFeCl3溶液0.5mL，混合均匀，静置10min后于700nm波长处测定其吸光度。吸光度越大，样品的总还原力就越强。

1.3.3 清除羟自由基(·OH)能力测定

采用酶解产物对Fenton体系产生的·OH清除率的体外实验法进行测定[12-13]。取0.2mL 10.0mmol/L FeSO4-EDTA混合液于5mL刻度试管中，样品管及阳性对照管中加入0.5mL 10.0mmol/LD-脱氧核糖溶液，试剂空白管及样品空白管加入双蒸水0.5mL。样品管及样品空白管加入0.6mL酶解液，其余用0.lmol/L pH7.4磷酸缓冲液定容至1.8mL，再加入0.2mL 10.0mmol/L H2O2。混匀后置于37℃恒温水浴中反应lh，然后加入质量浓度为2.8g/100mL三氯乙酸溶液1.0mL，4000r/min离心20min，取上清液2.0mL于另一支试管中，加入质量浓度为1.0g/100mL硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，混匀后置沸水浴中反应15min，冷却后稀释5倍，在波长532nm处测其吸光度。酶解产物对·OH的清除效果用清除率表示，按式(1)计算。

式中：A0为试剂空白的吸光度；A1为阳性对照管的吸光度；A2为样品管的吸光度；A3为样品空白的吸光度。

1.3.4 清除DPPH自由基能力测定

DPPH自由基清除率的体外实验测定参照文献[14-15]的方法。取不同质量浓度的紫菜蛋白酶解液稀释液(0.075、0.15、0.3、0.6、1.2mg/mL)2mL，加入1×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液2 mL，混匀后在室温避光反应30min，在517nm波长处测定吸光度，空白组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。酶解产物对DPPH自由基的清除效果用清除率表示，按式(2)计算。

式中：A0为对照组吸光度；A1为样品组吸光度；A2为空白组吸光度。

1.3.5 紫菜酶解产物分子质量分布测定

酶解产物分子质量分布采用凝胶层析法测定[16-17]，由SephadexG-15柱(1cm×49.6cm)分析检测。以5mmol/L pH7.0磷酸缓冲液为洗脱液，流速为0.4mL/min，上样量为2mL，QuadTecTM检测器检测，检测波长280nm。标准品分别为L-酪氨酸(Mr=181.19)、一磷酸腺苷(Mr=347.2)、辅酶I(Mr=681.44)、杆菌肽锌(Mr=1486.2)，用缓冲液配成5mg/mL的溶液备用，用蓝色葡聚糖2000测定柱床体积(Vt)和柱外水体积(Vo)，然后由标准品的保留时间计算出相应的洗脱体积(Ve)，以相对分子质量的对数值(lgMr)为横坐标，分配系数Kav[即(Ve－Vo)/(Vt－Vo)]为纵坐标绘制标准曲线。样品的相对分子质量根据其洗脱体积由标准曲线求得。

2 结果与分析

2.1 紫菜蛋白酶解液的还原力

还原能力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而使自由基变为稳定的分子，从而失去活性，还原力越强，抗氧化性越强[2]。依据1.3.2节的测定方法，3种酶解液还原能力测定结果见表2。

表2 紫菜蛋白酶解液的还原能力(x±s，n=3)Table 2 Reducing power of three hydrolysates (x ± s，n=3A)700nm

由表2可见，随着底物质量浓度的增加，吸光度也增加，相应的还原能力也增强，与阳性对照VC相比较(VC在0.075mg/mL时的吸光度即达到1.204)，其还原能力还是很弱的。3种蛋白酶酶解物的还原力有明显差异，还原能力大小顺序为：胃蛋白酶酶解物、胰蛋白酶酶解物、木瓜蛋白酶酶解物。

2.2 紫菜蛋白酶解产物清除羟自由基能力

图1 3种紫菜蛋白酶解液与VC对·OH的清除能力Fig.1 Scavenging rates of three hydrolysates and VC against hydroxyl radicals

·OH是已知的最活泼活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基。3种酶解液和VC对·OH的清除作用结果如图1所示。在研究的质量浓度范围内，随着质量浓度的增大，其清除能力也逐渐增强。在底物质量浓度小于0.775mg/mL时，清除能力大小依次为：木瓜蛋白酶酶解液、胰蛋白酶酶解液、胃蛋白酶酶解液；在底物质量浓度大于0.775mg/mL时，清除能力大小依次为：胰蛋白酶酶解液、木瓜蛋白酶酶解液、胃蛋白酶酶解液，胃蛋白酶酶解液的清除能力始终最小。与VC比较，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的紫菜酶解产物对·OH清除能力强于VC，也高于文献[2]报道的BHT对·OH的清除率。

为准确量化比较3种蛋白酶的酶解产物清除·OH活性的大小，将3种酶解液配制成不同质量浓度的溶液，测定其对·OH的清除率，绘制清除率对底物浓度曲线，由此计算出清除率为50%时活性肽溶液的质量浓度值即IC50值。IC50值越小，酶解液的清除·OH能力越强，抗氧化能力也越强。图2为木瓜蛋白酶酶解液对·OH清除能力的量效关系图。

图2 木瓜蛋白酶酶解液对·OH的清除能力Fig.2 Fitted curve of scavenging rate against hydroxyl radicals versus papain hydrolysate concentration

由图2可见，木瓜蛋白酶酶解产物清除·OH能力随着质量浓度的升高而增强，且清除率与质量浓度之间存在良好的对数回归关系，由回归方程计算出其IC50值为0.397mg/mL。同样方法可以测定并计算胰蛋白酶酶解液IC50值为0.486mg/mL、VC IC50值为1.356mg/mL、胃蛋白酶酶解液IC50值为1.656mg/mL。可见，木瓜蛋白酶酶解产物对·OH清除能力最强，胃蛋白酶酶解产物最弱。不同蛋白酶对紫菜蛋白的水解作用不同，其酶解产物对·OH的清除能力也存在差异，由于木瓜蛋白酶酶解产物的分子质量最小，能参加反应的氨基酸侧链暴露较多，其清除能力也强。

2.3 紫菜蛋白酶解物清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一种较为稳定的以氮为中心的自由基，它具有3个芳环结构，属于芳香类自由基，研究抗氧化剂样品直接捕获或与DPPH自由基相结合的行为，可以大致推测抗氧化剂对芳香自由基的清除能力。图3为3种酶解液和BHT清除DPPH自由基能力的实验结果。

由图3可见，在研究的酶解产物质量浓度范围内，随着质量浓度的增大，其清除能力也逐渐增强，呈正相关关系。3种酶解液清除能力由大到小为：胃蛋白酶酶解产物、木瓜蛋白酶酶解产物、胰蛋白酶酶解产物，它们的清除能力皆弱于BHT。

图3 3种紫菜蛋白酶解液与BHT对DPPH自由基的清除能力Fig.3 Scavenging rates of three hydrolysates and BHT against DPPH radicals

为了准确量化比较3种蛋白酶酶解产物清除DPPH自由基能力大小，参照研究酶解液清除羟自由基IC50值的方法，将3种酶解液和BHT的实验数据与半数清除率浓度实验结果列于表3。

表3 3种紫菜蛋白酶解液与BHT对DPPH自由基的半数清除率质量浓度Table 3 IC50 concentrations of three hydrolysates and BHT

由表3可见，胃蛋白酶酶解液清除DPPH自由基能力最强，胰蛋白酶酶解液最弱，阳性对照物BHT的半数清除率质量浓度为0.247mg/mL，清除活性高于3种酶的酶解产物。活性肽对DPPH自由基的清除作用与其自身的氢给予能力有关，DPPH自由基通过接受电子或H·形成稳定的反磁性分子，水解程度越大，活性肽可提供H·的基团越少，清除能力越弱。

2.4 酶解产物相对分子质量分布

实验测得SephadexG-15柱的Vo为17.95mL，Vt为38.96mL，由各标准品的保留时间计算出相应的Ve，进而计算出有效分配系数Kav，制作标准曲线图4。图5为木瓜蛋白酶对紫菜蛋白酶解产物的层析色谱图。

图4 SephadexG-15凝胶层析测定相对分子质量标准曲线图Fig.4 Standard curve for molecular weight determination by Sephadex G-15 column chromatography

图5 紫菜蛋白木瓜蛋白酶酶解产物的SephadexG-15层析色谱图Fig.5 Sephadex G-15 chromatogram of papain hydrolysate

由图5可见，木瓜蛋白酶酶解产物层析图谱出现了3个洗脱峰，但第1峰不太明显，可以不视为单独的洗脱峰。因此，具有较高抗氧化作用的活性肽主要为第2、3洗脱峰。经计算第2峰的分子质量为1403u，第3峰的分子质量为372u。

图6 紫菜蛋白胰蛋白酶酶解产物的SephadexG-15层析色谱图Fig.6 Sephadex G-15 chromatogram of trypsin hydrolysate

经测定计算，胰蛋白酶酶解产物层析图谱出现了3个洗脱峰，如图6所示，对应的分子质量分别为1897、1002u和151u；胃蛋白酶酶解产物层析图谱同样出现了3个洗脱峰，如图7所示，对应的分子质量分别为1963、1095u和148u。

图7 紫菜蛋白胃蛋白酶酶解产物的SephadexG-15层析色谱图Fig.7 SephadexG-15 chromatogram of pepsin hydrolysate

因此，由3种紫菜蛋白酶解产物抗氧化活性肽的分子质量范围可知，在3种酶的适宜水解条件下，水解产物主要为分子质量在2000u以内的小分子肽。

3 结 论

对3种不同蛋白酶酶解产生的紫菜蛋白酶解产物的总还原能力及清除自由基的能力进行了研究，通过还原能力大小、清除率以及半数清除率质量浓度的比较得出结论：3种蛋白酶酶解产物有一定的还原能力，但弱于VC；酶解产物对·OH和DPPH自由基清除能力与样品质量浓度之间呈正相关关系；对·OH清除活性由强到弱的顺序为：木瓜蛋白酶酶解产物、胰蛋白酶酶解产物、胃蛋白酶酶解产物，半数清除率质量浓度分别为0.397、0.486、1.656mg/mL；对DPPH自由基清除活性由强到弱的顺序为：胃蛋白酶酶解产物、木瓜蛋白酶酶解产物、胰蛋白酶酶解产物，半数清除质量浓度分别为0.261、0.423、1.140mg/mL。综合以上的实验数据与结论，木瓜蛋白酶酶解产物在清除两种自由基方面都具有较强的清除能力，木瓜蛋白酶可以作为今后进一步研究的首选蛋白酶。

酶解液用SephadexG-15凝胶层析分离测定，证明其主要为分子质量在148～1963u之间的小分子肽。紫菜蛋白水解产生的小分子肽具有良好的抗氧化活性，可以作为生物活性物质开发保健食品或应用于食品工业。

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Antioxidant Activity of Bioactive Peptides fromPorphyra yezoensis

YAO Xing-cun，JIANG Hui，SHU Liu-quan，PAN Sai-kun
(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Bioactive peptides were prepared fromPorphyra yezoensisby hydrolysis with papain, trypsin or pepsin, theirin vitroantioxidant activity was assessed based on reducing power and scavenging effects against hydroxyl radicals and DPPH radicals, and their molecular weight distribution was also measured. The results showed that three enzymes could better hydrolyzePorphyra yezoensisproteins, producing hydrolysates with obvious reducing power. The three hydrolysates had dosedependent positive scavenging effects on hydroxyl radicals and DPPH radicals, among which, the papain hydrolysate had the best hydroxyl radical scavenging activity, with a half-scavenging concentration (IC50) of 0.397 mg/mL, and the pepsin hydrolysate was the best scavenger against DPPH radicals with an IC50 of 0.261 mg/mL. The molecular weight distribution of small-molecule antioxidant peptides in the three hydrolysates was determined to be in the range of 148 to 1963 u.

Porphyra yezoensis；hydrolysis；bioactive peptides；antioxidant activity

TS254.1

A

1002-6630(2011)07-0104-05

2010-08-03

江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题(2008HS015)

姚兴存(1963—)，男，副教授，学士，研究方向为海洋贝藻类精深加工与利用。E-mail：yaoxingcun@126.com