牛初乳乳清IgG的低温乙醇和三聚磷酸钠预提取技术研究

郭 斌，王志耕，2，*，孔 鹏，梅 林，2，薛秀恒，2

（1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036；2.安徽省乳制品工程技术研究中心，安徽合肥 230000）

牛初乳乳清IgG的低温乙醇和三聚磷酸钠预提取技术研究

郭 斌1，王志耕1，2，*，孔 鹏1，梅 林1，2，薛秀恒1，2

（1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036；2.安徽省乳制品工程技术研究中心，安徽合肥 230000）

探讨了初乳乳清IgG的低温乙醇法和三聚磷酸钠法两种预提取方法。通过正交实验确定了低温乙醇法最佳工艺参数为：乙醇浓度30%、pH6.7、离子强度0.06mol/kg，IgG纯度和回收率分别为39.28%、79.32%；三聚磷酸钠法最佳工艺参数为：三聚磷酸钠添加量0.5%、pH 4.0、温度45℃，IgG纯度和回收率分别为33.74%、82.31%。两种方法结合超滤法作为安全有效的预提取法均可应用于工业化生产食品级IgG。

牛初乳，免疫球蛋白，低温乙醇，三聚磷酸钠

免疫球蛋白（Ig）是牛初乳中最引人注目的免疫因子，Ig总含量为50mg/mL，其中约80%～86%为免疫球蛋白G（IgG）。从功能性食品角度考虑，天然牛初乳IgG具有较广谱的抑菌效果，特别是对导致胃肠道疾病的病原微生物具有良好的抑制和杀灭效果。具有活性的牛初乳IgG到达肠道后可特异性地结合、清除肠道中的致病菌，从而起到预防治疗疾病的作用[1]。从牛乳中分离的IgG已成为婴幼儿配方奶粉及其它保健品中的重要添加成分，牛IgG的含量直接决定了产品质量及价格[2]。现代社会建立的庞大乳品工业体系已经能够保证牛初乳作为一种功能性食品及其制造基料的来源。超滤法是目前公认最有前途的提取初乳IgG的工业化方法之一[3]，但牛初乳是一种成分复杂的高蛋白基料，直接超滤难免会造成严重的膜污染，增加超滤膜的清洗成本，降低超滤膜的寿命[4]。因此，对牛初乳进行预处理是十分必要的。目前，低温乙醇分离法已经广泛应用于人血白蛋白、人血免疫球蛋白的工业化[5]，生产血浆IgG的低温乙醇法可为初乳乳清中IgG的工业化提供借鉴。三聚磷酸钠作为一种食品添加剂，通常被添加在肉类食品中用于增加产品的保水性，亦可以作为絮凝剂使用[6]。二者作为食品级IgG工业化制备的沉淀剂有安全无毒、操作简便等优势。本实验拟研究低温乙醇和三聚磷酸钠在初乳乳清IgG预提取中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛初乳 采集自六安华园乳业有限公司饲养的无乳腺炎、分娩后3d内的健康乳牛；牛IgG标准品、羊抗牛IgG免疫血清（效价1∶32） 索来宝生物试剂公司；凝乳酶 科汉森公司；其他试剂 均为分析纯。

Expert 18K-R型冷冻离心机 长沙新奥实验仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；pH-3B精密pH计上海精密科学仪器有限公司；HJ-3型控温磁力搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；HH-S型恒温水浴锅 江苏金坛国胜实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 初乳乳清的制备 将牛初乳经4℃、4000r/min下离心20min脱脂后，加入0.06‰的凝乳酶，置于35℃的恒温培养箱中30min，待其凝固结块后打碎凝块，在4℃、4000r/min下离心20min去除酪蛋白，即得到初乳乳清。

1.2.2 乙醇处理法 以乙醇作为提取沉淀剂时，影响目标蛋白纯度和回收率的主要因素有乙醇浓度、pH、离子强度、温度、蛋白浓度等[7]，本实验选取乙醇浓度（8%、20%、25%、30%、40%，V/V）、pH（4.6、5.8、6.7、7.4、8.1）、离子强度（0.03、0.06、0.09、0.12、0.15mol/kg）三个因素设计单因素实验。以0.5mol/L的冰醋酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调整初乳乳清至所需的pH，取50mL乳清加入相应体积-20℃的无水乙醇，再加入NaCl调整离子强度，置于4℃的冰箱中静置2h后，4℃、4000r/min下离心20min，取沉淀用无菌PBS溶液溶解定容至50mL。根据单因素实验的结果设计正交实验如表1，每组实验设计三组重复。

表1 低温乙醇分离初乳乳清IgG实验因素水平表

1.2.3 三聚磷酸钠处理法 选取三聚磷酸钠添加量（0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%，W/V）、pH（3.5、4.0、4.6、5.8、6.7、7.4、8.1）、温度（4、25、35、45、55℃）三个因素设计单因素实验。以0.5mol/L的冰醋酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调整初乳乳清至所需的pH，取50mL乳清添加不同比例的三聚磷酸钠，分别置于不同温度下2h后，4℃、4000r/min下离心20min，去除沉淀，取上清液[8]。根据单因素实验结果设计正交实验如表2，每组实验设计三组重复。

表2 三聚磷酸钠分离初乳乳清IgG实验因素水平表

1.2.4 总蛋白含量测定 采用南京建成生物工程研究所提供的蛋白定量（双缩脲法）测试盒测定。

1.2.5 IgG含量测定 采用免疫透射比浊法[9]测定。

1.2.5.1 抗体稀释液的配制 称取Tris 6.21g、NaCl 4.50g、PEG 6000 25.00g、BSA 0.50g、NaN30.50g，用适量蒸馏水溶解，以1mol/L HCl溶液调整pH至7.4，定容至500mL。

1.2.5.2 IgG标准曲线的制作 将牛IgG标准品配制成0.100、0.150、0.250、0.400、0.650、0.900、1.150、1.400、1.650、1.950mg/mL的溶液，用抗体稀释液将羊抗牛IgG免疫血清稀释16倍，取210μL稀释后的抗体液与12μL标准IgG溶液混匀，37℃孵育40min，以0浓度的样品管作为空白，在340nm波长处测定吸光度。制作标准曲线如图1。

图1 免疫透射比浊法IgG浓度标准曲线

1.2.5.3 样品IgG含量的测定 取210μL稀释后的抗体液与12μL待测样品混匀，37℃孵育40min，以0浓度的样品管作为空白，在340nm波长处测定吸光度，由标准曲线方程计算出样品IgG的浓度。

1.2.6 纯度和回收率的计算

1.2.7 统计分析 应用SAS 9.1中的duncan方差分析进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 乙醇处理法

2.1.1 乙醇浓度对初乳乳清IgG纯度和回收率的影响添加不同浓度乙醇的各组样品测定IgG浓度和总蛋白浓度结果如图2，计算IgG纯度和回收率如图3。

图2 不同乙醇浓度对IgG浓度和总蛋白浓度的影响

图3 不同乙醇浓度对IgG纯度和回收率的影响

由图2可以看出，IgG浓度随着乙醇浓度的增加呈现先增加后减小的趋势，在乙醇浓度为25%时达到最大，之后随着乙醇的浓度不断增大，IgG的活性被破坏而浓度减小；而总蛋白浓度一直呈增加趋势，主要由于乙醇降低了可溶蛋白质的介电常数[10]，可溶性蛋白质不断沉淀下来。由图3可知，IgG的纯度和回收率均在乙醇浓度为25%时达到最大，分别为36.14%和65.70%。因此，乙醇浓度应选择为25%。

2.1.2 pH对初乳乳清IgG纯度和回收率的影响 不同pH的各组样品测定IgG浓度和总蛋白浓度结果如图4，计算IgG纯度和回收率如图5。

图4 不同pH对IgG浓度和总蛋白浓度的影响

图5 不同pH对IgG纯度和回收率的影响

IgG在pH3.5～7.0范围内相对较为稳定[1]。由图4可以看出，IgG浓度随着pH的增大呈平稳的增加趋势，在pH8.1时达到最大，而总蛋白浓度随着pH的增大逐渐降低，在pH为7.4时达到最小，此时可溶性蛋白的沉淀量最小，说明初乳乳清中等电点处于pH7.4的蛋白质含量较少。如图5所示，在pH为7.4时，IgG的纯度也达到最大值38.52%，回收率的变化比较平稳，综合考虑纯度和回收率，确定pH为7.4。

图6 不同离子强度对IgG浓度和总蛋白浓度的影响

图7 不同离子强度对IgG纯度和回收率的影响

2.1.3 离子强度对初乳乳清IgG纯度和回收率的影响 不同离子强度的各组样品测定IgG浓度和总蛋白浓度结果如图6，计算IgG纯度和回收率如图7。

由图6可以看出，IgG浓度随着离子强度的增加逐渐增加，在离子强度为0.09时达到最大，之后逐渐降低；总蛋白浓度一直呈下降趋势，但总体变化情况较为平稳。由图7可以看出，离子强度为0.12mol/kg时IgG纯度达到最大值34.71%，回收率为74.27%；离子强度为0.09mol/kg时，IgG回收率达到最大值76.22%，纯度为34.53%。综合考虑IgG纯度和回收率，选择离子强度为0.09mol/kg。

2.1.4 正交实验 低温乙醇分离初乳乳清IgG正交实验设计和结果见表3。

表3 低温乙醇分离初乳乳清IgG实验设计及结果分析

表4 低温乙醇分离初乳乳清IgG方差分析表（纯度）

表5 乙醇分离初乳乳清IgG方差分析表（回收率）

由表4对IgG纯度正交实验结果的方差分析表明，乙醇浓度、pH、温度对IgG提取纯度的影响均达到极显著水平（p<0.01），各因素的影响程度为乙醇浓度>pH>离子强度。实验的最佳条件为A1B3C2，以此条件进行验证实验测得IgG纯度为39.66%，回收率为63.41%。

由表5对IgG回收率正交实验结果的方差分析表明，pH、离子强度对IgG提取纯度的影响均达到极显著水平（p<0.01），乙醇浓度的影响达到显著水平（p<0.05），各因素的影响程度为pH>离子强度>乙醇浓度。实验的最佳条件为A3B1C1，此条件下IgG纯度为39.28%，回收率为79.32%。

以IgG纯度和IgG回收率两个指标为参考对象得到的两组最佳实验条件中，后者比前者在回收率提高了15.91%的情况下，纯度只降低了0.38%，因此，选择后者作为最佳工艺参数更加合适。

2.2 三聚磷酸钠处理法

2.2.1 三聚磷酸钠添加量对初乳乳清IgG纯度和回收率的影响 添加不同三聚磷酸钠的各组样品测定IgG浓度和总蛋白浓度结果如图8，计算IgG纯度和回收率如图9。

图9 不同三聚磷酸钠添加量对IgG纯度和回收率的影响

由图8可以看出，IgG浓度随着三聚磷酸钠添加量的增加呈现先增大后减小的趋势，在三聚磷酸钠添加量为0.1%时达到最大；总蛋白浓度呈现先减小后增大的趋势，在三聚磷酸钠添加量为0.4%时达到最小，三聚磷酸钠与乳清中某些蛋白质结合使得可溶性蛋白质含量降低[6]。由图9可以看出，在三聚磷酸钠添加量为0.4%时，IgG纯度为33.59%，亦为最大值。综合回收率的变化情况，三聚磷酸钠的添加量可确定为0.4%。

2.2.2 pH对初乳乳清IgG纯度和回收率的影响 不同pH的各组样品测定IgG浓度和总蛋白浓度结果如图10，计算IgG纯度和回收率如图11。

图10 不同pH对IgG浓度和总蛋白浓度的影响

由图10可以看出，IgG浓度在pH为4.0时最大，之后随着pH的增大不断降低，由于IgG随着pH的增大达到了等电点逐渐沉淀下来，上清液中的IgG含量降低；总蛋白浓度在pH为4.6时最大。由图11可以看出，IgG纯度在pH为4.0时最大，为31.48%，而IgG回收率此时也达到最大值，为69.61%；因此，选择pH为4.0。

图11 不同pH对IgG纯度和回收率的影响

2.2.3 温度对初乳乳清IgG纯度和回收率的影响 不同温度的各组样品测定IgG浓度和总蛋白浓度结果如图12，计算IgG纯度和回收率如图13。

图12 不同温度对IgG浓度和总蛋白浓度的影响

图13 不同温度对IgG纯度和回收率的影响

由图12可以看出，IgG浓度随着温度的升高呈现先增加后减小的趋势，总蛋白浓度的变化情况亦然，两者均在温度为35℃时达到最大，超过35℃后活性IgG含量逐渐降低。由图13可以看出，IgG回收率在4～35℃内逐渐升高，在35～65℃内逐渐降低，在35℃时达到最大；IgG纯度变化趋势较为平稳，在45℃时达到最大，之后逐渐降低。综合纯度和回收率应选择35℃为提取温度。

2.2.4 正交实验 三聚磷酸钠分离初乳乳清IgG正交实验设计和结果见表6。

由表7对IgG纯度正交实验结果的方差分析表明，pH对IgG提取纯度的影响达到极显著水平（p<0.01），三聚磷酸钠添加量的影响达到显著水平（p<0.05），温度的影响不显著。其最佳实验条件为A3B2C3，以此条件进行验证实验测得IgG纯度为33.74%，回收率为82.31%。

由表8对IgG回收率正交实验结果的方差分析表明，三聚磷酸钠添加量、pH和温度三个因素对IgG回收率的影响均达到极显著水平（p<0.01），各因素的影响程度为pH>三聚磷酸钠添加量>温度。其最佳实验条件为A3B3C3，以此条件进行验证实验测得IgG纯度为30.72%，回收率为86.50%。

表6 三聚磷酸钠分离初乳乳清IgG实验设计及结果分析

表7 三聚磷酸钠分离初乳乳清IgG方差分析表（纯度）

表8 三聚磷酸钠分离初乳乳清IgG方差分析表（回收率）

以IgG纯度和回收率两个指标为参考对象得到的两组最佳实验条件中，后者比前者的回收率虽然提高了4.19%，但纯度却降低了3.02%。在生产中，在回收率差异较小的情况下，IgG纯度作为直接衡量产品质量的指标[11]应给予优先考虑，因此，应选择前者作为实验的最佳工艺参数。

3 结论

3.1 低温乙醇提取初乳乳清IgG的最佳工艺参数为：乙醇浓度为30%，pH为6.7，离子强度为0.06mol/kg，此时IgG纯度为39.28%，回收率为79.32%。

3.2 三聚磷酸钠提取初乳乳清IgG的最佳工艺参数为：三聚磷酸钠添加量0.5%，pH为4.0，温度为45℃，此条件下IgG纯度为33.74%，回收率为82.31%。

3.3 两种方法提取牛初乳IgG操作简便、安全可靠、成本低廉。在后续实验中结合超滤法进一步提取浓缩IgG的纯度可提高至56.51%，可应用于工业化生产食品级IgG。

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Study on pre-extraction technology of whey IgG from bovine colostrum with low-temperature ethanol and sodium tripolyphosphate methods

GUO Bin1,WANG Zhi-geng1,2,*,KONG Peng1,MEI Lin1,2,XUE Xiu-heng1,2

（1.College of Tea&Food Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China；2.Dairy Engineering Research Center of Anhui Province,Hefei 230000,China）

Two methods of pre-extraction for whey IgG from bovine colostrum with low-temperature alcohol and sodium tripolyphosphate were discussed in this test.The optimal technological parameters of low-temperature ethanol method were obtained through orthogonal tests:ethanol concentration of 30%，pH 6.7，and ionic strength of 0.06mol/kg，the purity and recovery of IgG were 39.28%and 79.32%，respectively；the optimal technological parameters of Sodium tripolyphosphate method were:Sodium tripolyphosphate addition of 0.5%，pH 4.0，temperature of 45℃，the purity and recovery of IgG were 33.74%and 82.31%，respectively.The two kinds of methods，as a safe and effective pre-extraction，combined with ultrafiltration can be applied to industrial production of food-grade IgG.

bovine colostrum； IgG； low-temperature ethanol； sodium tripolyphosphate

TS252.1

B

1002-0306（2011）10-0344-05

2010－10－12 * 通讯联系人

郭斌（1985-），男，硕士研究生，研究方向：营养与食品卫生学。