产2-酮基-D-葡萄糖酸菌Serratiasp.BK-98的分离及其培养条件优化

张 炜，谢志鹏，张建国

（浙江大学生物化学研究所，浙江杭州310058）

产2-酮基-D-葡萄糖酸菌Serratiasp.BK-98的分离及其培养条件优化

张 炜，谢志鹏，张建国*

（浙江大学生物化学研究所，浙江杭州310058）

从土壤中分离得到一株2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KDG）产生菌，综合16S rDNA序列和系统进化分析确定该菌属于沙雷氏菌属（Serratia），命名为Serratia sp.BK-98。 采用Plackett-Burman（PB）实验设计，从影响2-酮基-D-葡萄糖酸生物合成条件的14个因素中筛选出具有显著效应的3个因子：装液量、发酵时间和初始pH。在此基础上通过中心组合设计实验（central composite design,CCD）和响应面分析（response surface methodology,RSM）确定了装液量、发酵时间和初始pH的最适值分别为6.6mL、57.9h和5.0。在优化条件下，2-KDG的100mL摇瓶发酵产量达到了187.8g/L，100L发酵罐产量达到了192.2g/L，分别较优化前提高了142.6%和148.3%，这两个实验结果均与模型的预测值191.4g/L非常接近。

培养条件，2-酮基-D-葡萄糖酸，优化，响应面法，Serratia sp.BK-98

2 -酮基-D-葡萄糖酸（2-KDG）有着广泛的用途，它能被用作食品添加剂、水泥增塑剂、洗涤剂，是照片显影剂的重要成分[1]；同时它也是除草剂[2]、D-核酮糖、D-阿拉伯糖，特别是D-异抗坏血酸合成过程中的重要前体[3]。2-KDG的生产方法主要有三种：发酵法、化学合成法和酶促法。由于微生物发酵法生产2-KDG具有操作简单、副产物少、生产成本低、反应条件温和、绿色环保等优点而备受国内外研究人员的青睐。自1935年Bernhauer和Görlich[4]从葡萄糖酸杆菌（Bacterium gluconicum）的发酵液中分离出2-KDG以来，许多具有2-KDG生产能力的菌株相继被报道，如荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）[5]，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）[6]，产酮产碱菌（Alcaligenes ketogenes）[7]。合适的培养条件对提高发酵产物的产量至关重要。响应面分析法是20世纪中后叶发展起来的优化实验条件统计学方法，相比传统的单因子和正交实验设计，响应面分析法具有实验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用等优点，优化效率高，在微生物培养条件优化方面已有广泛应用[8-10]。本文从土壤中筛选得到一株具有生产2-KDG能力的菌株，结合16S rDNA序列和系统进化分析表明该菌属于沙雷氏菌属（Serratia），以此菌株为出发菌株，采用响应面法（response surface methodology，RSM）对其培养条件进行优化。首先采用Plackett-Burman（PB）设计筛选出影响沙雷氏菌发酵的重要因素，然后通过中心组合设计实验（central composite design，CCD）和响应面分析对这些重要因素进行优化，确定最佳的发酵条件，为后续放大实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

筛选培养基（g/L） 葡萄糖200，酵母膏5，自然pH；固体培养基（g/L） 葡萄糖200，酵母膏5，琼脂20，自然pH；种子培养基（g/L） 葡萄糖10，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3，MgSO4·7H2O 3，pH=6.7；初始发酵培养基 （g/L） K2HPO40.7，KH2PO40.7，MgSO4·7H2O 0.3，葡萄糖200，工业鱼蛋白胨19，尿素1.5，CaCO350，pH=6.7。所有培养基灭菌条件均为115℃灭菌20min。

SW-CJ-1FD型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LXQ-LS-SII型立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PHSJ-3F型实验室pH计 上海精科实业有限公司；XS-205型电子天平瑞士梅特勒-托利多集团；LHZ-111型落地式恒温振荡器 上海精宏实验设备有限公司；Agilent-1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；薄层层析硅胶板青岛海洋化工厂分厂；100L发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的分离和鉴定 将从浙江省杭州市收集的菜园土壤放入盛有筛选培养基的摇瓶中，在30℃，250r/min摇床中培养72h，然后根据稀释平板法将培养液涂布在盛有固体培养基的平板中，30℃培养48h。将得到的单菌落保藏，并筛选2-KDG产量最高的菌株。根据该菌株的16S rDNA基因中的特异保守序列设计PCR引物，扩增该菌株的16S rDNA基因，通过测序并用CLUSTALW 1.6.A软件将序列与Eztaxon（http://www.eztaxon.org/）中已知16S rDNA序列进行多序列比对，然后根据邻接法用MEGA 4.0构建系统发育树，初步确定该菌株在分类学中的位置。

1.2.2 培养条件 种子培养条件：将保藏的斜面菌种接种到盛有25mL种子培养基的100mL摇瓶中，在28℃，250r/min摇床中培养21h。优化前的发酵培养条件：取种子培养液以7%（v/v）接种量接入盛有20mL发酵培养基的100mL摇瓶中，在28℃，230r/min摇床中培养62h。

1.2.3 实验设计

表1 PB实验各因素水平

表2 N=20的PB实验设计与结果

1.2.3.1 PB设计 影响2-KDG产量的可能因素有K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、工业鱼蛋白胨、尿素、CaCO3等的浓度，以及接种量、温度、装液量、发酵时间、初始pH、种龄、摇床转速等。实验选用N=20的PB设计安排，对这14个因素进行研究，另设4个因素为虚拟变量，用于估计误差，实验设计的每个因素取两个水平，根据前期实验来确定，各因素水平取值见表1，实验设计表见表2。所有实验重复三次，最后取平均值。

1.2.3.2 中心组合设计 根据PB设计实验筛选出的具有显著效应的因素，采用中心组合设计实验进行优化，实验设计表见表3。所有实验重复三次，最后取平均值。采用软件Minitab 15.0进行实验设计和数据分析。

表3 中心组合实验设计与结果

1.2.4 2 -KDG的分析方法 2-KDG的定性分析采用薄层层析（TLC）法：展开剂为吡啶:乙酸乙酯∶乙酸∶水（5∶5∶1∶3，v/v），显色剂为0.2%邻苯二胺酒精溶液（含1%浓硝酸）[11]，硅胶板在使用前先在105℃烘箱中烘20min。

2 -KDG的定量测定采用高效液相色谱法（HPLC）：参考文献[12]。

2 结果与讨论

2.1 产2-KDG菌株的分离和鉴定

从土壤中分离出来的单菌落经过摇瓶培养后先用TLC筛选出能产2-KDG的菌株，之后再用HPLC筛选出2-KDG产量最高的菌株BK-98用于进一步的优化实验。测序结果表明该菌株的16S rDNA片段约1456bp，16S rDNA基因序列在GenBank的登录号HM565931。将该序列与Eztaxon（http://www.eztaxon.org/）中已知16S rDNA序列进行多序列比对，构建以16S rDNA序列为基础的系统发育树（图1）。结果表明，BK-98与沙雷氏菌属（Serratia）同源性很高，与Serratia nematodiphila同源性更是达到99.656%（GenBank登录号EU036987）。因此，可以初步确定BK-98属于沙雷氏菌属（Serratia），并将该菌株命名为Serratiasp.BK-98。

图1 邻接法构建的基于16S rDNA基因序列的菌株Serratia sp.BK-98与相关菌株的系统发育树，括号里的数值为Genbank登录号，分支处的数值为自展值

2.2 PB实验设计筛选重要因素

采用PB实验设计从众多影响Serratiasp.BK-98发酵的因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究用。PB实验结果见表2。对表2的实验结果进行回归分析，分析结果见表4。

表4 PB实验设计的回归分析

由表4可知，此回归模型的决定系数R2为97.99%，表明模型构建非常成功。由表1可知，对2-KDG发酵过程有显著影响的因素有装液量、发酵时间、初始pH、摇床转速和温度，它们的效应分别为47.54，30.44，25.84，24.18和12.18。其中装液量、初始pH和温度对产2-KDG的影响呈现出负效应,发酵时间和摇床转速对产2-KDG的影响呈现出正效应。图2进一步显示了各个因素的显著性水平。由于三个以上的因素会大量地增加CCD实验的次数，一般选择不超过三个的因素做CCD实验[13]。故本文选择影响效应最大的三个因素（装液量，发酵时间和初始pH）进行CCD实验。摇床转速和温度两个因素则根据正负效应水平，摇床转速取高水平值，温度取低水平值。

图2 影响2-KDG产量的14个因素效应的帕累托图

2.3 RSM法优化2-KDG发酵条件

采用中心组合实验设计确定三个显著因素（装液量、发酵时间和初始pH）的最优水平，实验结果见表3。对所得的实验结果进行多元回归分析得到以下二次多项式模型：

其中Y代表2-KDG的产量，C、E和F分别代表装液量、发酵时间和初始pH。

回归模型的方差分析见表5，F检验P=0.000说明回归在统计学上是非常显著的，同时，该模型失拟项的P值大于0.05，说明该模型失拟不显著。此外，该模型的决定系数R2=0.9717，说明回归方程的拟合程度很好，可以应用于Serratia sp.BK-98发酵生产2-KDG的分析和预测。

表5 二次多项式模型的方差分析

回归模型中各项的系数估计见表6，从表6可知，一次项中C和E对2-KDG发酵有显著影响，二次项中CF对2-KDG发酵有显著影响，其余项对2-KDG发酵的影响不显著。响应面图3～图5直观地反映了各个因素对响应值的影响。图3说明装液量对2-KDG产量的影响极大，当装液量增大时，2-KDG产量迅速减少。这个实验结果与Misenheimer等人[6]的报道一致。从图中可以看出当装液量为10mL时，2-KDG的产量为175.1g/L，当装液量为20mL时，2-KDG的产量快速减少为106.3g/L。这可能是因为装液量过大，溶氧浓度迅速下降，当发酵液中的溶氧浓度降至临界氧浓度以下，糖代谢受到了显著的影响。图4表明发酵时间也显著地影响2-KDG产量。当发酵时间大于68h，随着发酵时间的延长，2-KDG产量明显增加。图5反映了初始pH和装液量的交互效应。初始pH和装液量均与2-KDG产量呈现负相关，2-KDG产量随着初始pH和装液量的减少而显著增加。

用Minitab软件求解方程得到装液量、发酵时间和初始pH的最佳条件分别为6.6mL，57.9h和5.0。在此最佳条件下，模型预测的2-KDG产量为191.4g/L。

表6 CCD实验设计的回归分析

图3 C和E对2-KDG产量影响的响应面图

图4 E和F对2-KDG产量影响的响应面图

图5 C和F对2-KDG产量影响的响应面图

2.4 模型验证

为了检验模型的准确性，在优化条件下进行验证实验，经三批100mL摇瓶培养重复实验，所得的2-KDG产量平均值为187.8g/L；此外，进一步在100L发酵罐上进行了三批重复实验，根据RSM优化结果可知Serratia sp.BK-98在发酵生产2-KDG过程中需氧量较大，故设定通气量为4.0m3/h，罐压为0.05MPa，装液量为55L，通过转速与溶氧串级使整个发酵过程中溶氧维持在10%以上，其他条件同摇瓶实验，最终2-KDG产量平均值为192.2g/L。摇瓶与发酵罐的实验值均与理论预测值非常接近，可见该模型可以较好地预测实际发酵情况。

3 结语

本文从土壤中分离筛选得到一株能产2-KDG的菌株，综合16S rDNA序列和系统进化分析确定该菌属于沙雷氏菌属（Serratia），并将该菌株命名为Serratia sp.BK-98。本文采用PB实验设计与响应面法相结合的方法优化Serratia sp.BK-98产2-KDG的发酵条件，从众多的影响因子中快速有效地筛选出主要影响因子并实现其水平的优化。优化后的Serratia sp.BK-98产2-KDG的最佳发酵条件为：装液量6.6mL，发酵时间为57.9h，初始pH为5.0，接种量7%（v/v），温度26℃，种龄21h，摇床转速260r/min，K2HPO40.7g/L，KH2PO40.7g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，葡萄糖200g/L，工业鱼蛋白胨19g/L，尿素1.5g/L，CaCO350g/L。在此优化条件下，经过三批100mL摇瓶培养重复实验，所得的平均值为187.8g/L，进一步的三批装液量为55L的100L发酵罐重复实验，所得的平均值为192.2g/L，两者的实验结果均与模型的预测值191.4g/L十分接近，与优化前的原始发酵条件下2-KDG的产量77.4g/L相比，摇瓶和发酵罐的2-KDG产量分别提高了142.6%和148.3%，这为进一步的发酵放大实验和工业化应用奠定了良好的基础。

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Optimization of culture conditions for producing 2-keto-D-gluconic acid by an isolated strain of Serratia sp.BK-98

ZHANG Wei,XIE Zhi-peng,ZHANG Jian-guo*

（Institute of Biochemistry,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

A strain capable of producing 2-keto-D-gluconic acid (2-KDG)was isolated from soil.The phylogenetic analysis based on 16S rDNA suggested the isolate was assigned to genus Serratia and named Serratia sp.BK-98.Medium loading volume，fermentation time and initial pH were found to be most significant factors affecting 2-KDG production using Plackett-Burman (PB)design and their values were optimized to be 6.6mL in a 100mL Erlenmeyer flask of medium loading volume，57.9h of fermentation time and 5.0 of initial pH respectively with response surface methodology(RSM)based on central composite design (CCD).Under the optimized fermentation conditions，2-KDG production in a 100mL Erlenmeyer flask and in a 100L fermenter reached 187.8g/L and 192.2g/L respectively，142.6%and 148.3%increase respectively as compared with the pre-optimized conditions.A close agreement with the predicted value of 191.4g/L indicated that the proposed relationship model between the impact factors and 2-KDG production was very practical.

culture conditions； 2-keto-D-gluconic acid； optimization； response surface methodology； Serratia sp.BK-98

TS201.3

A

1002-0306（2011）10-0264-05

2010－09－28 * 通讯联系人

张炜（1986-），男，硕士研究生，研究方向：发酵工程。