莲房原花青素的提取纯化技术研究

崔 倩，蒋益虹，戴 蕾，林 颖

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310029)

莲房原花青素的提取纯化技术研究

崔 倩，蒋益虹*，戴 蕾，林 颖

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310029)

对莲房原花青素的提取纯化工艺条件进行了研究，得到较优提取工艺为:提取温度50℃，提取溶剂60%乙醇，料液比1∶30，提取时间30min。采用大孔吸附树脂D－101、DA－201、DM－301和聚酰胺树脂对原花青素进行纯化，结果表明，大孔树脂DA－201对莲房原花青素有较好的吸附和洗脱效果，以70%乙醇为洗脱剂，初步得到纯化的莲房原花青素，洗脱率为84.1%。

莲房，原花青素，提取，纯化

莲房为莲科药用植物莲(Nelumbo Nucifera Gaertn.)的成熟花托(又名莲蓬壳，Seedpod of the Lotus，简称LS)。莲花历史悠久，我国约有二百种不同种型的莲。莲在我国种植广泛，据报道，1999年种植面积就已经超过了40000hm2［1］。莲子和莲藕是人们喜爱的食品，而莲房经常都被当作废弃物大量丢弃。《本草纲目》中记载，荷花、莲子、莲衣、莲房、莲须、莲子心、荷叶、荷梗、藕节等均可药用。莲房体轻，质疏松，纵向破开多裂隙似海绵，棕色。莲房中含有蛋白质、脂肪、糖类、粗纤维、胡萝卜素、VB、尼克酸、VC及微量莲子碱等多种化学成分［2］，为传统中药材，具有消淤、止血祛湿之功效。近年报道，莲房中富含原花青素——莲房原花青素(procyanidins of lotus seedpod，简称LSPC)，是莲房的主要活性成分之一。现代生物活性研究表明，LSPC具有较强的清除自由基和抗脂质过氧化活性［1］、抗心肌缺血［3］、调节血脂［4］、抑制癌细胞生长［5］及防辐射［6］等多种生物活性和药理作用。然而，目前国内外对于莲房原花青素的研究多集中在活性功能方面。本研究旨在建立较完善的莲房原花青素的提取、纯化方法，为莲房资源的综合利用开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莲房 将一定量新鲜(去籽)莲房清洁干净，撕片，65℃干燥至恒重，粉碎，过100目筛，于干燥避光处保存备用;儿茶素对照品 中国药品生物制品检定所;聚酰胺树脂 浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂;大孔吸附树脂 DA－201、DM－301、D－101 天津市海光化工有限公司;无水乙醇、NaOH、冰乙酸等分析纯。

722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;循环水式多用真空泵 上海豫康科教仪器设备有限公司;HL－2恒流泵 上海精科实业有限公司;Z系列层析柱、BS－100A自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 原花青素含量的测定(香草醛法)

1.2.1 标准曲线 精确称取儿茶素对照品约10mg，用蒸馏水溶解后，转移到10m L容量瓶中定容，摇匀，作为母液备用。分别精密吸取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5m L标准品母液，置于10m L容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。用香草醛法(取1m L样品于10m L具塞玻璃管中，加入2.5m L浓度为30g/L的香草醛－甲醇溶液，再加入2.5m L浓度为30%的硫酸－甲醇溶液，摇匀，避光反应10m in，以去离子水为空白，在最大吸收波长500nm处测定吸光值)，以浓度为纵坐标，吸光值为横坐标，得出回归方程。

所取标准液的浓度和吸光度值数据经回归处理，计算得回归方程为 y=2.2868x+0.023，R2=0.9998;其中x为儿茶素浓度，y为波长500nm处测定的吸光度值。结果表明儿茶素浓度在0.052～0.26mg/m L范围内与吸光度值线性关系良好。

1.2.2 原花青素含量测定 取1m L样品于10m L具塞玻璃管中，加入2.5m L浓度为30g/L的香草醛－甲醇溶液，再加入2.5m L浓度为30%的硫酸－甲醇溶液，摇匀，避光反应10m in，以去离子水为空白，在最大吸收波长500nm处测定吸光值［7］。

1.3 莲房原花青素的提取

准确称取莲房粉末2g，加入一定量一定浓度的乙醇溶液，于一定温度(水浴)提取一次，每5min振摇一下。提取一定时间后进行抽滤，滤液定容至100m L，取4m L再定容至50m L，取1m L测定原花青素含量。

1.4 莲房原花青素的柱层析纯化

1.4.1 树脂的筛选 选择4种树脂，树脂用95%乙醇浸泡24h，用蒸馏水洗至无酒精味;再用1%NaOH浸泡3～4h，滤掉上层碱液，以蒸馏水洗至中性;用4倍量10%醋酸浸泡3～4h，再用蒸馏水洗至中性并浸泡备用［8］。

准确称取处理好的树脂10g(抽滤去除树脂表面水分)，置于200m L三角瓶中，加入40m L原花青素粗提液，置于气浴恒温振荡器，30℃、120r/min振荡24h。取上清液 2m L用蒸馏水定容至 50m L，在500nm处用香草醛法测定滤液的吸光值［9］得到静态吸附率。取吸附平衡的树脂，用蒸馏水冲洗树脂至滤液无色，置于三角瓶中加入100m L 90%乙醇洗脱树脂，于气浴恒温振荡器30℃、120 r/m in振荡24h，测定洗脱液的吸光度得到静态解吸率。通过对吸附量、吸附率和解吸率的比较选择一种合适的树脂。

1.4.2 静态吸附与解吸附

1.4.2.1 静态吸附动力学测定 称取已处理好的树脂10g，置于200m L三角瓶中，加入40m L原花青素粗提液，不时振荡，每隔30min取1m L溶液定容至10m L，用香草醛法在500nm测定吸光值，连续测定4h左右，观察树脂对原花青素的吸附量与时间的关系。

1.4.2.2 静态吸附等温线测定 称取6份已处理好的大孔树脂DA－201，各2.5g，分别置于100m L三角瓶中，加入10m L不同浓度的原花青素粗提液，摇床振荡(30℃、120r/min)，1h后取 1m L溶液定容至10m L，用香草醛法在500nm处测定吸光值。

1.4.3 动态吸附与解吸附

1.4.3.1 层析柱的制备和上样 称取80g备用树脂DA－201，湿法装入内径25mm、高40cm的玻璃交换柱中，树脂层高度约为25cm。待层析柱中的蒸馏水流尽后，室温下以上样流速0.8m L/m in进样，进样浓度为2.33mg/m L的原花青素粗提液150m L。

1.4.3.2 层析柱的洗脱 室温下用相同的流速上蒸馏水，洗下树脂中水溶性的杂质。大约100m L蒸馏水可洗脱干净。待水洗流出液为无色后，用50%的乙醇溶液冲洗树脂吸附柱，洗脱液以0.8m L/m in的速度洗脱，采用部分收集器每5m in收集一管，按顺序记为1，2，3……36，再用可见光分光光度计于波长500nm处用香草醛法检测吸光值，观察洗脱出峰情况。

1.4.3.3 比较不同浓度乙醇的洗脱效果 按照上文所述的上样方法上样，吸附结束后，先用100m L的蒸馏水洗去水溶性杂质，再分别选用50%、70%、90%乙醇溶液作为洗脱剂，以0.8m L/m in的洗脱速度对吸附饱和的大孔树脂进行洗脱。收集洗脱流出液测定原花青素含量，计算洗脱率。

2 结果与分析

2.1 莲房原花青素提取工艺的研究

2.1.1 单因素实验 在其它条件相同的情况下，乙醇浓度、提取温度、时间和料液比对提取效果的影响结果见图1～图4。

图1 乙醇浓度对莲房原花青素提取率的影响

图2 温度对莲房原花青素提取率的影响

图3 提取时间对莲房原花青素提取率的影响

图4 料液比对莲房原花青素提取率的影响

由图1可见，乙醇浓度达到60%时，原花青素的提取率最高，再升高原花青素提取率已略有下降的趋势，分析产生这种现象的原因可能是随着乙醇浓度的增大，一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量增加，这些成分与原花青素竞争同乙醇－水分子结合，从而导致提取率降低［10］。图2表明，随着温度的升高，原花青素的提取率有升高的趋势，但是在工业中温度的升高需要付出较大的成本，而且温度升高容易破坏一些活性成分，因而选择50～60℃比较合适。由图3可见，时间对提取率的影响不大，20m in基本已经达到提取完毕的效果，随着时间的延长，提取率反而有减少的现象，很可能是原花青素长时间加热被破坏。图4表明，料液比从1∶15到1∶30，提取率有显著的增长，而之后再增加溶剂体积，提取率开始下降，因此认为1∶30为合适的料液比。

2.1.2 正交实验 在单因素实验的基础上，应用正交实验四因素三水平设计，考察提取温度、乙醇浓度、料液比、提取时间对莲房中原花青素提取效果的影响，并分析得到较优的实验组合。因素水平安排如表1。

表1 因素水平表

表2 正交实验方案及结果

由表2实验结果可见，莲房中原花青素的最佳提取工艺为:提取温度50℃，提取溶剂60%乙醇，料液比1∶30，提取时间30m in。各种因素对提取效果影响的主次顺序依次为乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间。通过极差分析检验可知，4种因素对提取率均有影响。

2.2 莲房原花青素的柱层析纯化

2.2.1 树脂的筛选结果 根据表3，聚酰胺树脂的吸附率与吸附量均最大，但是解析率最小，这对于原花青素原料会有很大的浪费，且不利于树脂的重复利用;D－101的解析率最高但是吸附率最小，会导致纯化的效率低下;综合考虑吸附率与解析率，认为大孔树脂DA－201为最佳的选择。

表3 不同树脂对莲房原花青素的吸附与解析

2.2.2 大孔树脂DA－201的静态吸附与解吸附

2.2.2.1 吸附动力学 大孔树脂DA－201对原花青素的吸附率与时间的关系见图5。可以看出，大孔树脂DA－201的吸附速度很快，30m in基本已经达到吸附饱和，饱和吸附率在36%左右。因此应使吸附时间大于30m in，以确保吸附平衡。

图5 大孔树脂DA－201对莲房原花青素的吸附动力学曲线

2.2.2.2 静态吸附等温线测定 不同浓度下树脂对原花青素的吸附量关系如图6。由图6可见，原花青素在树脂上的吸附量随着提取液浓度的增加而增大。但同时，吸附率会随着提取液浓度的增加而减小，所以选择浓度时要综合考虑。树脂的吸附率一般与上样溶液的浓度成反比，通常以较低浓度进行吸附较为有利，如果上样浓度偏高，则吸附率会显著减少［11］。

图6 大孔树脂DA－201对莲房原花青素的吸附等温线

2.2.3 大孔树脂DA－201的动态吸附与解吸附 动态上样的吸附曲线如图7。

由图7可见，当流出液为74m L时，树脂达到饱和吸附，饱和吸附量为3.4mg/g湿树脂。

图7 大孔树脂DA－201吸附动力学曲线

以原花青素浓度(mg/m L)对洗脱液体积(m L)作图得动态解吸曲线，如图8。

图8 洗脱曲线

从图8可见，乙醇溶液通过50m L左右时，原花青素开始被洗脱下来，然后迅速达到高峰，乙醇溶液通过120m L后，洗脱液浓度基本保持在一个低点，有拖尾现象。

2.2.4 比较不同浓度乙醇的洗脱效果 不同浓度乙醇的洗脱率见表4。

表4 不同浓度乙醇的洗脱效果

由表4可知，70%乙醇的洗脱能力高于其他2种浓度的乙醇溶液，为比较适合的洗脱剂，洗脱率可达84.1%。

分别合并收集到的洗脱液，在40℃减压蒸馏除去洗脱液中的乙醇和水，通过喷雾干燥可得原花青素产品为浅黄色粉末。

3 结论

3.1 对原花青素的提取条件进行了探讨，结果表明，莲房中原花青素的最佳提取工艺为:提取温度50℃，提取溶剂 60%乙醇，料液比1∶30，提取时间30m in。在此条件下，采用硫酸－香草醛法，以儿茶素为对照品，测定莲房粉中原花青素的干基含量为7.58%，比一般葡萄籽原花青素的得率(4.6%)高，因此它是一种新的、很有应用前景的原花青素生产原料。

3.2 综合 3种大孔吸附树脂 D－101、DA－201、DM－301和聚酰胺树脂的静态吸附－解吸附性能，可以看出，大孔吸附树脂DA－201是最合适的原花青素纯化树脂，具有吸附快、易解吸等特点。

3.3 以DA－201为填充料制备层析柱，上样流速0.8m L/m in，2.33mg/m L的原花青素粗提液达到吸附饱和的时间为92m in，湿树脂的动态饱和吸附量为3.4mg/g。相同流速下，100m L的蒸馏水可以洗去溶于水的杂质。

3.4 分别选用50%、70%、90%乙醇溶液作为洗脱剂，得到洗脱率最高的为70%的乙醇。上柱液浓度为2.97mg/m L，流速为0.8m L/m in时，70%的乙醇溶液洗脱率达到84.1%，且出峰快，但有拖尾现象。

［1］ZHI－QUN LING，BI－JUN XIE，ER－LING YANG.Isolation，Characterization，and Determination of Antioxidative Activity of Oligomeric Procyanidins from the Seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn［J］.J Agric Food Chem，2005，53:2441－2445.

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Study on the extraction and purification of procyanidins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn.

CUI Qian，JIANG Yi－hong*，DAILei，LIN Ying

(Bioengineering ＆ Food Science College of Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

The extraction and purification technology of the procyanid ins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn.were studied.The optimum extraction conditions were as follows:extraction temperature 50℃，ethanol concentration 60%，the ratio of sample to solvent volume(W/V)1∶30，extraction time 30m in.Under this condition，the yield of procyanid ins was 7.5%.The procyanid ins were further purified with macroporous resins D－101，DA－201，DM－301 and polyamide resin，the results showed that the resin DA－201 had better adsorption and elution of procyanid ins from the lotus seedpod.The ratio of stripping was 84.1%when eluting with 70%ethanol.

lotus seedpod;procyanidins;extraction;purification

TS201.2

B

1002－0306(2011)08－0238－04

2010－01－15 *通讯联系人

崔倩(1985－)，女，硕士研究生，从事天然产物方面的研究。

浙江省教育厅课题(N20080086);浙江省科技厅项目(N20080439)。