花生种子中凝集素的凝集活性及性质研究

孙 杰，吕敬军，陆丰升，杨庆利，*，毕 洁，张初署，于丽娜，朱 凤

(1.山东省花生研究所，山东青岛266100;2.临沂市农业委员会，山东临沂276000; 3.沂水县农业局，山东沂水276400)

花生种子中凝集素的凝集活性及性质研究

孙 杰1，吕敬军2，陆丰升3，杨庆利1，*，毕 洁1，张初署1，于丽娜1，朱 凤1

(1.山东省花生研究所，山东青岛266100;2.临沂市农业委员会，山东临沂276000; 3.沂水县农业局，山东沂水276400)

利用血凝实验及糖抑制实验测定花生种子中凝集素的凝血活性及糖抑制专一性，同时进行热稳定性及pH影响实验。结果显示:花生种子的凝集素粗提液不能凝集人的A、B、O型血细胞，但是可以凝聚唾液酸酶处理后的A、B、O型血细胞。凝集素对红细胞的凝集可被乳糖、蜜二糖、棉籽糖和D-半乳糖四种糖所抑制，在pH为5.0～11.0范围内较稳定，经55℃保温10min后，活性完全消失。在检测的6个不同品种的花生中，河北高油的种子中凝集素活性最强。在花生的生长初期，这种凝集素的存在部位是子叶和根。

花生，凝集素，凝集反应，性质

1 材料与方法

1.1 实验材料

花生种子 花育12号，收于山东省花生研究所实验站;人的A、B、O型血样 青岛市401医院检验科提供;唾液酸酶(Neuraminidase N2876) 购自Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生种子凝集素粗提液的制备 将花生种子去皮。称取5g去皮的花生种子，用电动研磨器磨碎。称取研磨后的花生粉3g，以1g∶30mL的比例加入石油醚，在30℃条件下，摇床脱脂5h。将脱脂后的液体抽滤，将滤渣放在培养皿中，在通风橱中晾干。晾干后每种样品加入30mL PBS，搅拌后放入4℃冰箱过夜。10000r/min离心20min，弃沉淀。上清液中加入固体硫酸铵至60%饱和度，4℃下搅拌2h，10000r/min离心20min，弃上清。沉淀溶于PBS，并用PBS透析过夜，离心除去少量杂质，上清即为花生种子凝集素粗提液。

1.2.2 凝集实验用红细胞的制备 人的A、B、O型血样全血，用3.8%(M/M)枸橼酸钠溶液抗凝，各抗凝血经2000r/min离心10min除去血浆，加10倍体积的PBS溶液充分洗涤，然后经1000r/min离心3min去上清液，重复4次，最后经2500r/min离心3min，配成2%(V/V)的PBS-红细胞悬浮液备用。

1.2.3 红细胞的唾液酸酶处理 每10mL红细胞悬液加入2mg唾液酸酶，37℃处理1h，再以PBS溶液洗涤三次，悬浮为2%～3%的红细胞悬液备用。

1.2.4 血凝实验 取血凝板一块，用微量移液器向各孔加入 PBS 25μL，向第一排每孔加血清样品25μL，做倍比稀释，然后逐行分别加入25μL唾液酸酶处理后的人O型红血球的2%悬液，在微型振荡器上振摇2min，室温下静置30min后观察结果。以能产生凝集的凝集素最大稀释度的倒数作为此凝集素的效价。每种血细胞的血凝实验重复三次。

1.2.5 糖溶液的配制 将半乳糖、乳糖、蜜二糖、葡萄糖、木糖、棉籽糖、蔗糖分别溶于PBS缓冲液中，配制成200mmol/L的糖溶液。

1.2.6 抑凝实验 取血凝板一块，用微量移液器向各孔加入 PBS 25μL，向第一排每孔加粗提样品25μL，做倍比稀释;然后再向第一行每孔中加入25μL PBS作为对照，向其它各行分别逐孔加入25μL给定浓度的各种糖溶液，在微型振荡器上振摇2min，室温下静置30min后，向各孔中加入25μL唾液酸酶处理后的人O型红血球2%～3%悬液，在微型振荡器上振摇2min，室温下静置30min后观察结果，糖的结合能力以凝集活力效价的减少为标准，即是否能抑制凝集素与红血球的结合为标准。每种糖溶液的抑凝实验重复三次。

1.2.7 热稳定性测定 将花生种子凝集素粗提样品分别在温度为30、40、50、55、60、70、75℃的恒温水浴中处理10min，测定各样品的凝集活力。

1.2.8 pH稳定性测定 在测定pH对花生种子中凝集素的凝集活性影响时，使用下列缓冲液:pH为4.0～6.0的HAc-NaAc缓冲液;pH为7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液;pH为10.0～11.0的Gly-NaOH缓冲液。将凝集素粗提样品的pH调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在4℃密封的容器中放置1h，然后将各溶液的pH调至7.4，测定各样品的凝集活力。

1.2.9 不同品种花生中凝集素活力测定 将豫花15、河北高油、鲁花12、F18、耐寒1号和SPI0566种花生种子去皮。称取5g去皮的花生种子，用电动研磨器磨碎。称取研磨后的花生粉3g，按1.2.1所述的方法获得不同品种的凝集素粗提液。按照1.2.4所述方法分别测量6种凝集素粗提液的血凝指数。

1.2.10 不同组织中凝集素的分布 选取鲁花12的种子10粒，在人工培养箱中栽种，培养条件为白天10h，26℃，夜晚14h，22℃，至三叶期。分别去根、茎、叶和子叶，液氮研磨后，以PBS溶解，10000r/min离心20min，弃沉淀。按照1.2.4所述方法检测上清液的血凝活性。

2 结果与分析

2.1 花生种子凝集素凝集效价的测定

分别测定了唾液酸酶处理之前和之后的人A、B、O型血细胞对花生种子凝集素的血凝活性，结果见表1。花生种子中凝集素对于没经过处理的各种血细胞没有凝集活性;对唾液酸酶处理后的A、B、O型血细胞都具有较强的凝集特性，其中对唾液酸酶处理后的O型血的凝集活性最强。凝集素最大的特点是能促使细胞凝集，比较直观的表现是使红血球凝集，但来源不同的凝集素能凝集的红血球也不一样。而所有这些作用都与凝集素最重要的性质——糖结合性有关。例如，王庆忠等［18］报道，豌豆(Pisum setivum L)，芸豆(Passels vulgaris)，黑豆(Dumasia cordifolia L)，黄豆(Glycine Inax)均可以凝集人的A、B、O型血细胞，豇豆(Vigna sinnsis)不能凝集人的血细胞，但是可以凝集家兔和鸡的血细胞。不同血细胞表面的糖类是不同的，不同种类的凝集素的糖类结合特性不一样，因此能够识别不同种类的血细胞。花生种子中的凝集素不能结合未处理的人的血细胞;但是用唾液酸酶将血细胞表面多糖中的唾液酸酶解后，花生种子中的凝集素就可以结合人的A、B、O型血细胞表面所暴露出的多糖，而且对处理后的O型血细胞凝集活性最强。这可能是三种血细胞表面的细微差异造成的。

表1 花生种子凝集素对人的血细胞的血凝指数

表2 各种糖类对花生种子凝集素与处理后人的O型血细胞凝集的抑凝结果

表3 花生种子凝集素在不同pH下的凝集活性

表4 花生种子凝集素在不同温度下的凝集活性

2.2 花生种子凝集素特异结合的糖类的测定

植物凝集素是一类具有高度特异性糖结合活性的蛋白，这是它们区别于所有其它植物蛋白的标志。植物凝集素之所以引起人们的广泛兴趣与它们可特异结合糖类的性质密切相关。植物凝集素特异结合的糖类很多，目前所知的表面糖类几乎都可以为某种凝集素所识别。实验中所选的11种糖中只有棉籽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖有抑凝作用。说明花生凝集素分子中有这些糖的特异性结合位点，而且花生凝集素多专一作用于外源(即非植物起源)多糖，见表2。不同的凝集素其特异结合的糖类可能是不同的，这是由凝集素的糖类结合区域——糖识别结构域(Carbohydrate recognition domain，CRD)的结构决定的。例如，芸豆、白沙豆、赤豆凝集作用可被蔗糖完全抑制，豌豆活性可以被果糖、黑豆活性可以被乳糖、黄豆活性被乳糖和蔗糖部分抑制［18］。说明这几种植物的糖识别结构域是存在差别的。

2.3 pH和温度稳定性的测定

经不同条件下血凝实验证明，花生凝集素最适pH范围为pH4.0～11.0(表3)，当温度达到55℃时，花生凝集素的血凝活性消失(表4)。说明花生种子中凝集素比较稳定，有广泛的温度和pH的适应范围。植物凝集素另一特性是它的稳定性。许多研究表明，很多植物凝集素都可以在通常使细胞内蛋白失活的条件下和很大的pH范围内保持活性和稳定，对很多蛋白酶不敏感且耐高温。它们中的大多数不会被动物或昆虫胃肠的蛋白酶降解，在很大的pH范围内稳定，比其它蛋白如胞内酶更具热稳定性;还有一些凝集素甚至是完全稳定的蛋白，例如，从刺蕈麻根茎中分离出的凝集素在5%三氯乙酸和0.1N的NaOH中保持稳定，沸煮也不会失活，所有通常使用的蛋白酶对它都不起作用［19］。

2.4 不同品种花生中凝集素活力的测定

由图1可知，本实验选用的6个花生品种中都存在凝集活性物质，各凝集素都对唾液酸酶处理后的人血细胞显示了凝集活性。粗提液中2号河北高油和3号鲁花12的凝集活性最强，其它品种的凝集活性相似。这六个品种中只有河北高油种子中凝集素效价较高，其余5种凝集素的凝集效价相差不大。可见，不同花生中的凝集素的活性不同，其凝集素的含量也存在差异。说明由于花生的品种、生长条件的差异，其凝集素的含量也存在差异。

图1 花生种子凝集素对不同花生品种的凝集活性注:花生品种由1～6分别是:豫花15，河北高油，鲁花12，F18，耐寒1号，SPI056。

2.5 不同花生组织中凝集素活力的测定

本实验选取了三叶期的花生根、茎、叶和子叶四种不同组织检测血凝活性，结果见图2。由图2可知，子叶中凝集素的血凝活性显著高于其他三种组织。在茎和叶中没有血凝活性，说明在花生的生长发育初期，花生种子中的凝集素主要表达的部位是子叶，其次是根。由此可以推断，花生种子中的这种凝集素的主要功能可能是作为储存蛋白或对储存物质进行包装、运输，或兼具有保护种子而免于动物取食的作用。具体的生理功能还有待进一步的实验验证。

图2 不同花生组织中凝集素的凝集活性

3 结论与讨论

通过血细胞凝集实验和抑凝实验证实，花生种子中存在一种凝集素，它对唾液酸酶处理后的人的A、B、O型血细胞有凝集作用;这种凝集活性能够被乳糖、半乳糖、棉籽糖等糖类所抑制。它的性质比较稳定，有广泛的温度和pH的适应范围，最适pH为5.0～11.0，当温度超过55℃时，生物活性消失。

关于花生种子中凝集素相关性质的研究国内还未见报道，在其他豆科植物中已经有凝集素单体的分离纯化的报道。由于凝集素单体对于糖链具有更加特异的识别能力，可以作为分子探针或糖专一性探针，研究癌变细胞膜糖链结构和细胞变异，研究特异细胞膜受体的分布等。下一步研究将总结前人的提取和纯化方法，探索花生种子中凝血活力较高的花生凝集素单体的纯化方法，阐明其性质和功能，使其在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用。

［1］周瑞宝.花生加工技术［M］.北京:化学工业出版社，2003.

［2］李娜.我国花生产业的现状与发展前景［J］.粮油食品科技，2008，16(6):38-39.

［3］屈宝香，罗其有，张晴，等.中国花生产业发展与食用植物油供给安全保障分析［J］.中国食物与营养，2008(11):13-15.

［4］张秀青，刘珉.中国花生产业国际竞争力实证研究［J］.河南农业科学，2008(11):42-46.

［5］Stephen D Wood，Lisa M Wright，Colin D Reynolds，et al. Structure of the Native(unligated)Mannose-specific Bulb Lectin from Scilla Campanulata(bluebelll)at l.7A Resolution［J］.Acta Cryst，1999，D55:1264-1272.

［6］孙册.凝集素［M］.北京:科学出版社，1986.

［7］Elizabeth H ParkS，Kaza Suguna，Eswara Subramanian.The Crystal Structure of Pea Lectin at 3.0-A Resolution［J］.J Biox chem，1956，261:16515-16527.

［8］Shran N，Coldstein I J.Lectins:More than insecticides［J］. Science，1998，282(6):1049.

［9］Hilder V A，Powell K S，Gatehouse AMR，et a1.Expressing of snowdrop lectin in transgenic tobacco plants results in added protection against aphids［J］.Transgenic Research，1995(4): 18-25.

［10］Jouanin L，Bottino M B，Girard C，et al.Transgenic plats for insect resistance［J］.Plant Science，1998:1311.

［11］Hiisch A M.Role of lectins(and rhizobial exopolysaccharides)in legume nodulation［J］.Current Opinion in Plant Bilolgy，1999(2):320-326.

［12］周德庆.微生物学教程［M］.北京:高等教育出版社，1993:87-89.

［13］王先酉，李明，张凤英.苍耳子凝集素的分离纯化和某些性质研究［J］.衡阳医学院学报，1998，26(1):37-40.

［14］李向东.植物凝集素及其防卫作用［J］.世界农业，1996，11:10-12.

［15］左贤云，陈义明，谢九泉.酸法提取柑橘皮果胶的条件研究［J］.华中农业大学学报，1993，12(3):296-298.

［16］高莹，瞿礼嘉，陈章良.植物凝集素的分子生物学研究［J］.生物技术通报，2002(5):18-22.

［17］何佳颖，陈寅生，饶小珍.凝集素及其生物学作用［J］.宁德师专学报:自然科学版，2005，17(1):19-22.

［18］王庆忠，张鹭，欧阳亮，等.菜豆凝集素的提取和部分性质研究［J］.中国临床医药研究杂志，2008，184:1-4.

［19］Peumans W J，Verhaert P，Pfüller U，et al.Isolation and partial characterization of a small chitin-binding lectin from mistletoe(Viscum album)［J］.FEBS letters，1996，396(2-3): 261-265.

Study on properties of lectin in seed of peanut(Arachis hypogaea L.)

SUN Jie1，LV Jing-jun2，LU Feng-sheng3，YANG Qing-li1，*，BI Jie1，ZHANG Chu-shu1，YU Li-na1，ZHU Feng1

(1.Shandong Peanut Research Institute，Qingdao 266100，China;
2.The Agriculture Committee of Linyi City，Linyi 276000，China; 3.Yishui County Bureau of Agriculture，Yishui 276400，China)

Lectin crude extraction from peanut seed were detected for agglutinating activity，glycoinhibiting action and thermostability.The influence of pH on those activities was also tested.The results showed that the lectin crude extraction could not agglutinate three kinds of human erythrocytes.But it showed a strong affinity for human A/B/O erythrocytes(RBC)by neuraminidase treated.Agglutinating activity of crude extraction to neuraminidase treated human O erythrocytes was inhibited by lactose，raffinose，melibiose and D-galactose.The agglutinating activity of peanut seed crude extraction was inhibited at temperatures higher than 55℃ and at a pH less than 5 or greater than 11.The agglutinating activity of Hebei Gaoyou was the strongest in the detected six different peanut cultivars. Cotyledon and root might contain this lectin in seed germination and seedling growth of peanut.

peanut;lectin;agglutinating activity;property

TS201.2

A

1002-0306(2011)08-0134-04

花生(Arachis Hypogaea L.)是世界上五大油料作物之一，约占世界植物油料年产量的14%。目前，全世界有100多个国家种植花生，总产量约3300万t。花生是我国主要的油料和经济作物之一，是食用植物油和蛋白质的重要来源。自上世纪90年代以来，我国花生种植面积基本稳定在7000万亩，仅次于印度列世界第二位;总产量约为1500万t，出口量在65～78万t之间，在全球花生生产中的地位举足轻重［1-2］。脂肪和蛋白质是花生中的第一和二大营养素。目前我国花生总产55%～60%的花生用于花生油的生产，花生蛋白资源远未得到充分利用，这主要是因为我国人民有食用花生油的传统，因此长期以来一直重视花生油的生产和加工，花生蛋白的研究并不占优势［3-4］。近年来，花生蛋白开始进入人们的视野并逐渐引起重视，对花生蛋白进行深入研究，阐明其性质和功能，成为当务之急。植物凝集素是一种含有非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的植物(糖)蛋白质［5］。凝集素最早于1888年由俄国的Stillmark最先在植物种子蓖麻籽中发现，当时取名为蓖麻素(ricin)。经过数十年的深入探索，已经在凝集素的性质、生理功能、基因结构域表达等方面取得了很大的进展［7-8］。凝集素最大的特点是能促使细胞凝集，比较直观的表现是使红血球凝集［6］。凝集素在其所在的机体内还有许多生理功能，如细胞与细胞间粘着、分子或离子的传递、雌蕊受粉、转基因抗虫［9-10］、共生固氮［11］、防御病原体侵入［12］等。豆科凝集素是来自豆科植物的一类同源蛋白，是目前研究得最为清楚的凝集素家族，已经从70多种植物中纯化得到了豆科凝集素，其中大部分来自种子，豆科凝集素还存在于叶片、茎、皮、根等营养器官中［13-15］。虽然凝集素的生化活性方面有大量的研究报道，但是，结构和功能研究的比较明确的只有少数几种凝集素［16-17］。本文对花生种子中凝集素的基本理化性质，糖结合特点进行了研究，为深入研究花生种子凝集素的性质、特点提供了前提，为阐明其生理功能奠定了基础。

2010-07-22 *通讯联系人

孙杰(1981-)，女，博士，助理研究员，从事食品科学与工程的研究。