淮山药薯蓣皂苷测定方法的研究

韩秋敏，李登超，黄亚东，韩正亮

(1.江苏食品职业技术学院生物与化学工程学院，江苏淮安 223003; 2.淮阴师范学院生命科学学院，江苏淮安 223300)

淮山药薯蓣皂苷测定方法的研究

韩秋敏1，李登超2，黄亚东1，韩正亮2

(1.江苏食品职业技术学院生物与化学工程学院，江苏淮安 223003; 2.淮阴师范学院生命科学学院，江苏淮安 223300)

对常用的紫外－可见分光光度法即香草醛－高氯酸法、香草醛－硫酸法和甲醇－硫酸法测定薯蓣皂苷含量的方法进行了比较研究。结果表明，不同显色方法所形成的化合物的最大吸收波长和稳定性有很大差别，其中硫酸－甲醇法最佳，最大吸收波长为332nm，60min内稳定性良好，且在2.4～24μg/mL范围内具有良好的线性相关。采用硫酸－甲醇法测定淮山药薯蓣皂苷的含量为0.535mg/g，RSD为1.06%，该法操作简单、精密度高、稳定性和重现性好，可用于淮山药薯蓣皂苷的含量测定。

淮山药，薯蓣皂苷，比色法

山药为薯蓣科植物薯蓣的块茎，它营养丰富，既可做主食食用，又可做蔬菜或酿酒原料，同时又是一味重要的滋补药物。现代研究表明，山药中含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪、无机盐和多种维生素等营养物质，还含有大量纤维素以及胆碱、皂苷、精氨酸、甘露聚糖、多酚氧化酶等成分，具有益智健脑、降低血糖、固肠止泻、止咳祛痰等多种作用;广泛用于滋补健身和防治多种疾病［1－3］。薯蓣皂苷(dioscin)广泛存在于薯蓣科、百合科、豆科等植物中，其中在薯蓣科植物中含量丰富，如穿龙薯蓣、山药、盾叶薯蓣等［4］。近年来随着分离提取技术的不断发展，多种薯蓣皂苷被分离出来，并不断发现其生物活性，特别是在抗肿瘤、免疫调节、降血脂等方面的作用不断被引起重视［5］。目前有关山药中薯蓣皂苷的含量的测定方法有很多种，主要有比色法、高效液相层析法、薄层扫描法等。其中比色法操作简便、快捷，不需要昂贵仪器，适于一般实验室的分析检测。常用的显色方法有香草醛－高氯酸法、香草醛－硫酸法和甲醇－硫酸法。皂苷显色的原理一般认为是强酸使羧基脱水而使其双键数目增加，又经双键位移后与显色剂缩合等反应形成共轭结构，最后在酸作用下形成碳正离子盐而显色［6－7］。因此，本文以当地资源丰富而又急待开发的淮山药和其中的活性物质薯蓣皂苷为主要研究对象，对上述三种比色法测定薯蓣皂苷含量的测定方法进行了比较研究，期望建立一种简便、快速而灵敏的薯蓣皂苷含量测定方法，为开发淮山药资源提供有价值的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

薯蓣皂苷对照品(纯度98%) 南京泽朗医药科技有限公司;鲜淮山药 购自淮安市农贸市场;其他所用试剂 均为市售分析纯。

UV757CR紫外－可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;HH－S恒温水浴锅 金坛市亿通电子有限公司;RE－52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;BS224S电子天平 北京赛多利斯科学仪器系统有限公司;DHG－92 40A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 精密称取薯蓣皂苷对照品1.2mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，备用。

1.2.2 香草醛－高氯酸法［8］取薯蓣皂苷标准液1mL，置于10mL具塞试管中，水浴挥干甲醇，加5%香草醛－冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸溶液0.8mL，摇匀，60℃水浴保温15min，取出后立即用冰水冷却，加入5mL冰醋酸稀释，以不加皂苷的平行样为空白对照，在400～1000nm范围扫描。

1.2.3 香草醛－硫酸法［9］取薯蓣皂苷标准液1mL，置于10mL具塞试管中，水浴挥干甲醇，加5%香草醛－冰醋酸溶液0.2mL，77%硫酸5mL，摇匀，60℃水浴保温15min，取出后立即用流水冷却，以不加皂苷的平行样为空白，在400～1000nm扫描。

1.2.4 甲醇－硫酸法［10－11］取薯蓣皂苷标准液0.4mL，置于10mL具塞试管中，水浴挥干甲醇，加硫酸－甲醇(7∶3)溶液5mL，60℃水浴保温1h，取出后冰水冷却，以不加皂苷的硫酸－甲醇溶液为对照，在200～1000nm范围内扫描。

1.3 淮山药中薯蓣皂苷的提取制备

1.3.1 淮山药的干燥工艺 淮山药→洗涤→去皮切片→护色→低温→干制→磨粉备用

选取无腐烂，无霉变斑点的新鲜淮山药，用流动的水冲洗干净其外部的泥土、沙粒等。用不锈钢刀去皮后，迅速切成2～3mm厚的薄片。将切好的山药片快速浸入护色液中(柠檬酸∶无水氯化钙∶蒸馏水为0.2∶0.2∶100)，使淮山药充分浸渍，不要露出到空气中，护色时间是1h。

将淮山药片铺摊在有筛眼斜盘上，送入干燥箱中，干燥温度在45℃左右，在干制初期注意排除湿气并且避免表面硬化，干制后期要注意温度，避免焦化。将烘干的淮山药冷却，磨成粉末，备用［12］。

1.3.2 回流法提取薯蓣皂苷［13］取5g干燥淮山药粉，精密称定，置于250mL的锥形瓶中，然后向其中加入80%甲醇，摇匀，在60℃条件下，回流提取6h，冷却后用布氏漏斗过滤，将滤渣回收置于锥形瓶中按照上面的操作重复提取一遍，将2次滤液混合浓缩至褐色粘稠状时冷却。将浓缩液用20mL蒸馏水溶解，然后用等体积的石油醚脱脂2次，取水层，将其浓缩至15mL。水溶液用水饱和的正丁醇萃取(在分液漏斗里面放入21mL水和100mL正丁醇，振摇提取数分钟，放置分层后取用上层的水饱和正丁醇即可)，萃取3次(每次5mL)，取正丁醇层浓缩，减压回收正丁醇。将得到的粗制品用甲醇溶解并定量转移到10mL容量瓶中，为测定液。

2 结果与分析

2.1 测定方法的选择

为了比较三种不同比色方法的优劣，对不同处理方法得到的化合物进行波长扫描(见图1)，并对形成的显色化合物在0～60min进行稳定性分析(见图2)。

图1 比色法吸光值扫描曲线

由图1可知，不同的显色方法，形成化合物的最大吸收波长和吸光度值均不同。香草醛－高氯酸法处理的化合物的最大吸收峰是481nm，吸光值是0. 913;香草醛－硫酸法处理的化合物最大吸收峰在458nm，吸光值是1. 019;甲醇－硫酸法处理的化合物最大吸收峰是332nm，吸光值0.526。图2显示的是不同处理方法得到的化合物在60min的稳定性。可以看出香草醛－高氯酸法的稳定性最差，60min吸收值下降了27.5%，RSD为8.29%(n=7);香草醛－硫酸法和甲醇－硫酸法的稳定性都很好，RSD分别为0.34%(n=7)和0.08%(n=7)，但甲醇－硫酸法峰形更好、灵敏度高，并且考虑到所用药品来源，甲醇易得价廉。因此，采用甲醇－硫酸法方法作为薯蓣皂苷比较适宜的测定方法。

2.2 标准曲线的绘制

分别吸取标准品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL具塞试管中，挥干溶剂，加硫酸－甲醇溶液5.0mL，60℃水浴保温1h，取出立即冰水浴冷却至室温，摇匀，在332nm测定吸光度值，结果如图3所示。由图3可知，薯蓣皂苷的含量在2.4～24μg/mL范围内，具有良好的线性相关性。回归方程为y= 0.0554x+0.0776，相关系数R2=0.9965。

表1 加样回收实验结果

图2 化合物在60min稳定性

图3 薯蓣皂苷的标准曲线

2.3 精密度实验

取同一份标准品溶液0.3mL，按2.2方法操作，重复测定6次，结果测定RSD=0.56%，表明该方法精密度良好。

2.4 重复性实验

取同一批次的样品6份，按1.3方法制备样品液，按2.2方法操作，并根据标准曲线进行计算，结果RSD=1.48%，表明该方法重复性较好。

2.5 加样回收实验

精密吸取供试样品液，精密加入一定量的标准品溶液，按照样品含量测定方法进行测定，结果见表1，计算加样回收率为98.2%。

2.6 淮山药样品测定

精密称取同一批次的山药粉3份，按回流法提取山药中的薯蓣皂苷，甲醇－硫酸法测定，根据标准曲线计算得山药中薯蓣皂苷的含量分别为0.540、0.537、0.529mg/g，平均含量为0.535mg/g，RSD为1.06%。

3 结论

本实验对比色法测定薯蓣皂苷含量不同显色剂的选择方面，进行了研究。实验表明，香草醛－高氯酸法在最大吸收峰处的吸光值最大，但稳定性差;香草醛－硫酸法、甲醇－硫酸法在最大吸收峰处的吸光值适中，稳定性好。但甲醇－硫酸法峰形更好，灵敏度高。甲醇－硫酸法测定薯蓣皂苷含量在2.4～24μg/mL范围内呈良好的线性相关。采用甲醇－硫酸法测定淮山药中薯蓣皂苷含量为0.535mg/g，RSD为1.06%。通过方法学实验表明，该法简便快捷、重现性好，精密度高。

［1］宋立人，洪恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典［M］.北京:人民卫生出版社，2001:159－162.

［2］徐琴，徐增莱，沈振国，等.淮山药多糖提取工艺的研究［J］.食品工业科技，2006，27(12):117－118，121.

［3］聂凌鸿.淮山药抗性淀粉的制备及其性质［J］.食品工业科技，2008，29(11):163－166.

［4］侯娟，何文辉，王明霞，等.薯蓣皂苷的药理作用［J］.河北医药，2004，26(1):71.

［5］王晓鹏，陆羡.薯蓣皂苷生物活性研究新进展［J］.国外医学中医中药分册，2004，26(3):138－141.

［6］孙耀军，邹建.皂苷不同测定方法的比较［J］.江西食品科技，2009(2):31－33.

［7］孔燕君，洪美凤.紫外分光光度法测定人参及三七中总皂苷含量［J］.中国现代应用药学，2000(1):51－52.

［8］谷利伟，谷文英.比色法测定大豆中的总皂甙［J］.中国粮油学报，2000，15(6):38－42.

［9］刘桂艳，刘墨祥，李泽鸿，等.西洋参果浆发酵加工皂甙含量变化研究［J］.北京中医药大学学报，2002，25(3):48－50.

［10］张健，李芳，李俊，等.蒺藜甾体皂苷的测试［J］.中医药研究，2000，16(4):48－49.

［11］张菊红，王志伟，金吉琴，等.蒺藜全草中总皂苷总含量的测定［J］.中国临床医学杂志，2001，10(4):244－246.

［12］黄桂东，钟先锋，吴龙奇.山药总皂甙的提取研究［J］.农产品加工·学刊，2006(11):42－45.

［13］钟先锋，黄桂东，刘建学，等.山药总皂甙的提取工艺研究［J］.农产食品科技，2007，1(1):11－14.

Study on the determination method of dioscin in Dioscorea opposita Thunb

HAN Qiu－min1，LI Deng－chao2，HUANG Ya－dong1，HAN Zheng－liang2
(1.School of Biological and Chemical Engineering，Jiangsu Food Science College，Huai’an 223003，China; 2.School of Life Sciences，Huaiyin Normal University，Huai’an 223300，China)

Commonly used ultraviolet－visible spectrophotometry methods，vanillin－perchloric acid method，vanillinsulfuric acid and methanol－sulfuric acid method，for determination content of dioscin were comparatively studied. The results showed that compounds formed under different treatments were very different at the maximum absorption wavelength and their stabilities.The methanol－sulfuric acid method was good，and the maximum absorption wavelength was 332nm，with good stabilities within 60min.The calibration curve was linear in the range of 2.4～24μg/mL.Average content of dioscin in Dioscorea opposita Thunb was 0.535mg/g with RSD 1.06%by the methanol－sulfuric acid method.This method was simple，accurate，sensitive and stable，which could be used for the quantitative determination of total dioscin in Dioscorea opposita Thunb.

Dioscorea opposita Thunb;dioscin;colorimetry

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0494－03

2011－06－27

韩秋敏(1976－)，女，讲师，硕士，主要从事生物化学与分子生物学方面的研究。