氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞connexin43表达的影响*

章顺荣， 洪鸣鸣， 高 越， 王晓楠， 封 菲

(杭州市第一人民医院老年医学科， 浙江 杭州 310006)

氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞connexin43表达的影响*

章顺荣△， 洪鸣鸣， 高 越， 王晓楠， 封 菲

(杭州市第一人民医院老年医学科， 浙江 杭州 310006)

目的研究氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白connexin43表达的影响。方法体外培养的内皮细胞分为4组：对照组，50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L ox-LDL干预组，干预24 h后通过RT-PCR方法检测各组connexin43 mRNA的表达有无差别；通过免疫细胞化学方法检测对照组和100 mg/L ox-LDL干预组之间connexin43蛋白的表达水平有无差别。结果不同浓度(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)的ox-LDL干预24 h能引起内皮细胞connexin43 mRNA的表达增加(P<0.01)；100 mg/L的ox-LDL干预24 h内皮细胞connexin43蛋白表达增加(P<0.01)。结论Ox-LDL短期干预可引起人脐静脉内皮细胞connexin43 mRNA和蛋白表达水平增加。

连接蛋白43； 脂蛋白类，低密度； 人脐静脉内皮细胞

动脉粥样硬化(atherosclerosis)是威胁人类健康的最常见的疾病之一，常引起重要脏器的严重病变(比如心肌梗死和脑梗死等)，而且随着人口的老龄化，其发生率有逐年上升趋势。然而，其发病机制目前尚未完全清楚，研究表明多种因素参与了动脉粥样硬化的发生、发展，其中内皮细胞功能异常起着重要的作用。组成缝隙连接(gap junction communication, GJIC)的蛋白亚单位称为connexins，现已发现有20种以上的connexins亚型，而内皮细胞表面有connexin43、40和37的表达。研究表明connexin43的改变在内皮细胞功能异常和动脉粥样硬化的发生发展中可能起着重要的作用[1]。另一方面，氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL, Ox-LDL)在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键的作用[2]，内皮下脂质沉留是动脉粥样硬化的始动因素[3]，ox-LDL可以通过多种机制促进动脉粥样硬化的发生发展[4]。目前尚未见研究报道ox-LDL是否可以通过影响内皮细胞connexin43而促进动脉粥样硬化发生发展。因此本研究对ox-LDL是否可影响体外培养的脐静脉内皮细胞connexin43的表达作一探索。

材 料 和 方 法

1材料

RPMI-1640细胞培养液、胰酶、PBS液、胎牛血清购自上海泽衡生物公司。内皮细胞株购自南京凯基生物公司。Trizol 和 RT-PCR试剂盒购自Invitrogen。Ox-LDL购自上海日初生物科技有限公司。Connexin43引物对和GAPDH引物对由上海泽衡生物公司合成。兔抗人connexin43多克隆抗体购于Abcam(Catalog Number: ab62689)。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体、山羊血清、C液购自北京中杉金桥生物科技有限公司。Triton X-100购自上海生工。DAB显色液购自福州迈新生物技术开发有限公司。

2内皮细胞培养及ox-LDL的干预

购买的人脐静脉内皮细胞株常规传代，接种于6孔板培养基，待内皮细胞长至约80%满后换液，对照组继续以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，而另外3组则在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中分别加入不同浓度的ox-LDL，使ox-LDL的终浓度分别为50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。继续培养24 h后，去除培养液，PBS液冲洗2遍后，加入Trizol 2 mL，常规提取各组的总RNA，-20 ℃条件下保存。

3RT-PCR检测connexin43mRNA表达

提取的各组RNA通过紫外分光光度计测定260和280 nm处吸光度值,计算RNA纯度和浓度。按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA第1链,再进行PCR扩增。用Premier 5.0软件设计PCR引物对，connexin43的PCR引物序列为上游 5’-GAGCGGATACAGAGGAGGA-3’,下游 5’-CTCCACCCATCTACCCCATAC-3’。内参GAPDH的引物序列为上游 5’-CGTGAAAGATGTCGTGGAA - 3’，下游5’-TGGAAGATGGTGATGGGAT-3’。Connexin43 PCR扩增条件为：95 ℃ 5 min 1循环，之后95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环，最后72 ℃ 10 min 1循环，产物长度为383 bp；内参GAPDH PCR扩增条件为：95 ℃变性5 min 1循环，之后95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环，最后72 ℃ 10 min 1循环，产物长度为223 bp。PCR反应体系为20 μL体系。PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳判断结果，Bio-Rad成像系统拍摄照片用于分析。

4免疫细胞化学检测connexin43蛋白的表达

4.1细胞爬片和ox-LDL的干预 传代后的内皮细胞按2×107cells/L浓度接种于含有载玻片的6孔板培养基，分为对照组和100 mg/L ox-LDL干预组，干预组设3复孔，待细胞生长至铺满约90%玻片后换液，对照组继续以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，而干预组则在培养液中加入100 mg/L(终浓度)的ox-LDL,两组均继续培养24 h后去除培养液，PBS液冲洗2遍后进行免疫细胞化学检测。

4.2免疫细胞化学染色 (1) PBS清洗标本 3次 各 1 min。(2)4%多聚甲醛固定 20 min。(3)空气干燥 5 min。(4)PBS清洗标本 3次各 2 min。(5)0.5% Triton X-100(DPBS配) 孵育1次 20 min。(6 )PBS清洗标本 3次 各 2 min。(7)3%H2O2孵育15 min。(8)DPBS清洗标本 3次各2 min。(9)山羊血清封闭20 min。(10)兔抗人connexin43抗体孵育(PBS配，滴度1∶200，湿盒)37 ℃ 60 min。(11)PBS清洗标本 3次 各 5 min。(12)Ⅱ抗工作液孵育(湿盒) 37 ℃ 30 min。(13) PBS清洗标本 3次 各 5 min。(14)C液(湿盒) 37 ℃ 30 min。(15)PBS清洗标本 3次 各 5 min。(16)DAB显色(避光，镜下观察至棕色 ) 约3-10min。(17)蒸馏水洗 2次 1 min。(18)苏木素复染 1 min后自来水冲洗。

4.3结果判断 每张切片随机连续观察5个高倍视野(×200),每处视野计数100个细胞: (1)各视野中阳性细胞率作为该切片的阳性细胞率进行计分。(2)染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征作为标准计分。具体计分方法按Formowitz评分法[5], 据染色程度(浅、中、深)及范围分别计分：细胞无着色记为0分，细胞轻度着色呈淡黄色记为1分，细胞着色呈棕黄色记为2分，细胞明显着色呈棕褐色记为3分；染色范围：<5%记分0分，5%-25%记为1分，25%-50%记为2分，>50%记为3分，将阳性细胞率和染色强度计分之和作为总分进行结果判定。结果分为4个等级: 0-1分为-， 2-3分为+，4-5分为++，6-7分为+++。

5统计学处理

运用ImageJ 1.43图像分析软件对mRNA电泳图片进行灰度扫描半定量分析。运用SPSS 14.0统计软件包进行数据统计分析。mRNA电泳图片采用各组connexin43条带与其GAPDH条带的灰度比值作为统计变量，采用t检验分析；免疫细胞化学结果按照染色强度等级采用Wilcoxon秩和检验分析。双侧P<0.05认为差异显著。

结 果

1不同浓度的ox-LDL对内皮细胞connexin43mRNA表达水平的影响

不同浓度(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)的ox-LDL干预24 h后引起内皮细胞connexin43 mRNA的表达水平增加，且呈浓度依赖性的改变，随着ox-LDL浓度的增加，connexin 43 mRNA表达水平的增加更加明显，见表1、图1。

Figure 1. The changes of connexin43 mRNA expression level in HUVECs after intervention of different concentrations(50 mg/L,100 mg/L and 200 mg/L)of ox-LDL.

图1不同浓度(50mg/L、100mg/L和200mg/L)ox-LDL刺激后内皮细胞connexin43mRNA表达水平

表1不同浓度ox-LDL干预后对HUVECsconnexin43mRNA表达的影响

GroupGrayvalueratioControl0．700±0．01350mg/Lox-LDL0．900±0．013∗∗100mg/Lox-LDL0．980±0．007∗∗200mg/Lox-LDL1．010±0．004∗∗

**P<0.01vscontrol group.

2Ox-LDL干预内皮细胞后对connexin43蛋白表达的影响

如图2所示，免疫细胞化学染色结果显示，2组细胞形态无明显差异，且均有connexin 43蛋白的表达。正常对照组内皮细胞中仅见较弱的connexin 43蛋白阳性染色，呈淡黄色，以+、++为主。而100 mg/L ox-LDL干预24 h后connexin 43蛋白阳性染色明显加深，呈棕褐色颗粒状，以++、+++为主，与正常对照组相比，100 mg/L ox-LDL干预24 h后connexin 43蛋白表达明显增强，差异显著(P<0.01，见表2。

Figure 2. The results of immunocytochemical staining. A: control group, a light yellow staining on the surface of endothelium cell could be seen; B: 100 mg/L ox-LDL intervention group, after intervention for 24 h with 100 mg/L ox-LDL, the staining on the surface of endothelium cell was denser, and the brown cytoplasm staining of endothelium cells was found.

图2免疫细胞化学染色图片

表2100mg/Lox-LDL干预24h后connexin43蛋白表达水平变化

Table 2. The changes of connexin43 protein expression level 24 h after intervention of 100 mg/L ox-LDL(n=6)

GroupCellstainingintensity-++++++Control0240100mg/Lox-LDL0015∗∗

**P<0.01vscontrol group.

讨 论

组成缝隙连接的蛋白亚单位称为connexins，现已发现人类有20种以上的connexins亚型，其中connexin43在人类主要表达在血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞，研究表明connexin43在动脉粥样硬化的发生、发展中起着重要作用。Blackburn等[6]研究发现人类冠状动脉粥样硬化的早期，其增厚的内膜中(平滑肌细胞间)缝隙连接蛋白connexin43表达明显增强。Kwak等[7]研究表明通过connexin43基因半敲除的LDL受体基因缺陷的小鼠(LDLR-/-Cx43+/-)与LDL受体基因缺陷的带有正常connexin43基因的小鼠(LDLR-/-Cx43+/+)相比，其connexin43蛋白表达减少，喂养高胆固醇饲料14周后其胸腹主动脉和主动脉根部动脉粥样病变比LDLR-/-Cx43+/+减少50%(P<0.01)；LDLR-/-Cx43+/-小鼠与LDLR-/-Cx43+/+小鼠相比，其粥样斑块中含更少的炎症细胞，有更厚的纤维帽，含更多的胶原和平滑肌细胞；同时发现，他汀类调脂药能减少人类血管细胞connexin43的表达，而他汀类药物的抗动脉粥样硬化作用可能也与此有关。这些结果减少connexin43的表达能减轻动脉粥样硬化，提示connxin43在动脉粥样斑块的形成中起着关键的作用。国内Wang等[8]研究表明洛伐他汀能减少兔主动粥样硬化斑块中connexin43和connexin40的表达。Gabriels等[9]观察到connexin43在血管内皮主要分布在血流紊乱的部位，如血管分叉的开口处，这些部位异常的切应力使内皮细胞connexin43的表达增高，同时这些部位也是动脉粥样斑块的好发部位。Dai等[10]模拟斑块易感和抵抗区域的动脉波型，应用于培养的内皮细胞，对其表型进行了观察，结果发现斑块易感波形引起connexin43表达上调，而斑块保护波形则与connexin37的水平升高有关。Chadjichristos等[11]等研究表明connexin43基因半敲除的LDL受体基因缺陷的小鼠(LDLR-/-Cx43+/-)球囊损伤颈动脉内膜后其新生内膜的厚度比LDLR-/-Cx43+/+的小鼠减小，巨噬细胞浸润也更少，这可为PCI术后再狭窄的防治提供一新的靶点。总之，目前的研究提示内皮connexin43可能具有促动脉硬化作用。

众所周知，氧化低密度脂蛋白在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键的作用[2]，ox-LDL可以通过多种机制促进动脉粥样硬化的发生发展。ox-LDL能诱导血管内皮细胞多种炎症因子的表达增加[12]，而动脉粥样硬化已被认为是一种慢性炎症的过程。因此我们设想作为动脉粥样硬化发病机制关键因素的ox-LDL是否能影响内皮细胞connexin43的表达而参与动脉粥样硬化的发生发展呢？据我们所知，目前国内外尚未见这方面的研究报道，因此是一个值得研究的靶点。本实验用ox-LDL干预体外培养的人脐静脉内皮细胞，以观察ox-LDL能否影响人脐静脉内皮细胞connexin43的表达。结果发现不同浓度(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)的ox-LDL能浓度依赖性地引起内皮细胞connxin43 mRNA的表达增加；免疫细胞化学的检测结果则提示，100 mg/L ox-LDL干预内皮细胞24 h后可引起connexin43蛋白的表达水平增加。这些结果提示ox-LDL干预内皮细胞后可引起缝隙连接蛋白connexin43 mRNA和蛋白的表达增加，从而促进动脉粥样硬化的发生发展。本研究结果支持内皮connexin43具有促动脉粥样硬化作用的观点。

至于ox-LDL引起内皮细胞connexin43表达增加的机制尚有待于进一步研究明确。本研究结果表明ox-LDL能引起内皮细胞connexin43 mRNA和蛋白的表达水平均增高，提示ox-LDL在转录水平引起connexin43基因的表达上调。目前研究表明，人类connexin43基因的转录调控涉及转录因子Sp1、Sp3、AP1、Nkx2.5、Tbx2等，此外，几条信号通路也参与了connexin43的转录调控，如PKC信号通路、Wnt信号通路和dibutyryl-cAMP信号通路等[13]。而Akiba等[14]研究表明在大鼠系膜细胞中ox-LDL能激活转录因子Sp1。因此推测，ox-LDL可能通过激活内皮细胞转录因子Sp1进而启动connexin43基因的转录，引起connexin43的表达增加。当然，ox-LDL更可能通过其它信号途径或者影响其它转录因子的活性而导致内皮细胞connexin43表达的增强，尚有待于进一步研究明确。

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EffectofoxidizedLDLonexpressionofconnexin43inculturedhumanumbilicalveinendothelialcells

ZHANG Shun-rong, HONG Ming-ming, GAO Yue, WANG Xiao-nan, FENG Fei

(DepartmentofGerontology,HangzhouFirstPeople’sHospital,Hangzhou310006,China.E-mail:zsr8888@126.com)

AIM: To investigate the effect of oxidized LDL (ox-LDL) on the expression of gap junction protein connexin43 in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)invitro.METHODSHuman umbilical vein endothelial cells cultured in normal condition were divided into blank control group, 50 mg/L,100 mg/L and 200 mg/L ox-LDL intervention groups. The mRNA expression of connexin43 in cultured HUVECs was detected with RT-PCR method; while the protein level of connexin43 was determined by the method of immunocytochemistry in the control and 100 mg/L ox-LDL intervention groups 24 h after ox-LDL was given.RESULTSDifferent concentrations (50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L) of ox-LDL up-regulated mRNA expression of connexin43 in cultured HUVECs after 24 h intervention (P<0.01). The protein level of connexin43 in cultured HUVECs intervened with 100 mg/L Ox-LDL for 24 h was up-regulated as compared to the control cells (P<0.01).CONCLUSIONOx-LDL may up-regulate the expression of connexin43 at mRNA and protein levels in cultured human umbilical vein endothelial cells within short time, indicating that connexin43 plays an important role in the pro-atherosclerotic effect of Ox-LDL.

Connexin43; Lipoproteins,LDL; Human vein endothelial cells

R541.4

A

1000-4718(2011)03-0589-04

2010-09-06

2010-10-26

浙江省医药卫生科技计划资助项目(No.2008B145)

△通讯作者 Tel:0571-87065701-21882； E-mail: zsr8888@126.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.033